不同溫度條件下生物質炭陳化對華南集約化菜地土壤反硝化過程的影響

劉一戈，胡家帥，王 朝，彭子倩，郝珖存，盧 瑛，李 博*

（1 華南農業大學資源環境學院，廣東廣州 510642；2 中交四航工程研究院有限公司，廣東廣州 510230）

氧化亞氮(N2O)是造成全球溫室效應的氣體之一，其增溫效應是二氧化碳(CO2)的296～310倍[1]。自工業革命以來，土壤對N2O排放的貢獻逐年增加[2]，其中農田土壤N2O排放占全球N2O排放增長的82%[3]，是N2O的重要排放源之一[4]。作為世界上最大的蔬菜生產國和消費國，我國蔬菜生產面積達6.67×106hm2(3 億余畝)，蔬菜年產量約達 5.5×108t，約占世界蔬菜總產量的50.7%[5–6]。集約化種植是支持我國蔬菜生產和消費的主要種植模式，目前對于集約化菜地土壤N2O排放機理的研究一直是全球農田土壤氮素管理的重要方向[7]。且由于集約化蔬菜地具有高集約化、高復種化、高施肥和灌溉頻繁等特點，易造成生產過程中較高的N2O排放風險。

華南地區是我國主要的集約化蔬菜生產地之一，其中廣東省蔬菜種植播種面積1.32×106hm2，占全國蔬菜播種面積的6.22%[6]。該地區年均降雨量與年平均溫度較高，土壤脫硅富鋁化過程劇烈，土壤偏酸性，持水性較差，有機質含量低，其碳氮轉化過程與機理具有特殊性。反硝化作用是指硝酸鹽()在厭氧條件下由反硝化微生物作用，經過一系列中間產物(、NO、N2O)最終還原為氮氣(N2)的過程，是集約化菜地土壤N2O最主要的排放源之一[8]，其速率分別由反硝化過程中不同酶活性與其編碼基因控制[9]。Li等[10]的研究表明，赤紅壤集約化菜地生產過程中土壤N2O的排放系數高達5%，集約化菜地N2O排放的主要來源為反硝化作用，且其排放具有獨特的水熱耦合特性。因此，亟需探索華南地區集約化蔬菜生產土壤N2O減排的有效措施及其減排機理。

生物質炭在農田生態系統中的施用是生物質循環利用的重要手段，其能夠改善土壤結構、養分有效性和微生物活性等，并在農田土壤氮循環領域具有不可低估的潛力[11]。研究表明，生物質炭施用已經成為農田生態系統中減少N2O排放的有效途徑，其最主要的減排機理為促進反硝化過程中N2O向N2的還原過程[12–13]。生物質炭進入土壤后會被逐漸氧化，其表面官能團(羥基和酚基)的變化，影響到生物質炭的物理和化學性質[14–15]，這一過程被稱為生物質炭的陳化作用。Cao等[16]研究表明，與新鮮生物質炭相比，生物質炭經陳化作用會降低其自身碳氮含量、pH和比表面積，增加生物質炭上的含氧官能團數量，增強對農田土壤氮素循環過程的影響。此外，在不同溫度條件下，生物質炭的減排效果也有所差異。Li等[10]在華南地區赤紅壤集約化菜地的田間試驗研究表明，生物質炭在土壤溫度大于20℃時具有較好的減排效果。華南地區處于亞熱帶和熱帶交界地區且雨熱同季，在此區域內生物質炭施用對農田土壤中N2O減排機理和時間效應還需進一步探索。因此，本研究設置3個溫度梯度及不同生物質炭處理，綜合運用乙炔抑制法[17]和土壤分子生物學技術進行室內培養試驗，通過測定土壤N2O排放、無機氮含量和反硝化關鍵酶基因豐度等指標，探究不同溫度條件下陳化生物質炭對土壤反硝化過程的影響機理。本研究假設陳化生物質炭能夠影響土壤反硝化過程反應底物含量與關鍵功能基因豐度，進而影響土壤N2O的排放，以期為我國集約化菜地生產過程中N2O減排與氮素管理策略制定提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料及其理化性質

供試土壤樣品取自相關田間試驗[10]，采樣時間為2019年10月21日，地點位于廣東省廣州市華南農業大學教學實驗基地(113°22' E，23°10' N)，試驗地主要種植萵苣(Lactuca sativaL.)、油麥菜(Lactuca sativa var longifoliaf.Lam)等葉菜類作物，具體田間試驗布置、處理設置以及農事措施參見Li等[10]。本試驗在兩年田間試驗結束后，應用五點采樣法采集表土層(0—15 cm)土壤作為供試材料，采集后去除雜物并混勻，過2 mm不銹鋼篩，保存在4℃冰箱備用。供試土壤類型為赤紅壤，成土母質為花崗巖，供試土壤在美國土壤系統分類中被歸類為老成土[18]，其表層土容重為1.15 g/cm3，總孔隙度為51%，黏粒 (粒徑＜2 μm)含量 25%，粉粒 (粒徑 2～20 μm)含量34%，砂粒(粒徑20～2000 μm)含量41%。土壤理化性質分析參考魯如坤《土壤農化分析》[19]，分析結果：全碳(TC) 22.3±1.1 g/kg、全氮(TN) 1.28±0.02 g/kg、陽離子交換量 9.96±0.34 cmol/g、-N 25.3±1.3 mg/kg、-N 17.5±2.7 mg/kg、容重 1.15±0.2 g/cm3、pH2.5:15.13±0.03。

試驗所使用生物質炭購自遼寧金色未來科技有限公司。該生物質炭以水稻秸稈為原料在500℃緩慢無氧熱解條件下生產獲得。本研究中應用的新鮮生物質炭性質如下：TC為506 g/kg； TN為1.9 g/kg；-N為2.5 mg/kg；-N 2.2 mg/kg；pH為9.5；灰分含量為9.6%。

1.2 試驗設計

采用室內培養法進行。試驗設3個生物質炭處理：1)不添加生物質炭(CK)；2)添加新鮮生物質炭(FB，fresh biochar)；3)田間施加20 t/hm2陳化生物質炭(FAB，field-aged biochar)，該處理為直接采集田間陳化兩年生物質炭(20 t/hm2)處理的土壤用于培養試驗，以盡量還原生物質炭在土壤中的真實陳化狀態。FB處理中的新鮮生物質炭添加量按照FAB中田間陳化生物質炭量20 t/hm2的生物質炭干重用量計算，相當于每克干土添加約0.012 g新鮮生物質炭。之后，稱取處理土壤20 g (干重)置于120 mL血清瓶內，添加相當于田間施肥量(CK處理) N 240 kg/hm2的KNO3溶液2 mL，并加入濃度為0.5 g/L的葡萄糖溶液1 mL，最后用稱重法加入蒸餾水，調整所有處理的土壤含水量至充水孔隙度(WFPS)的90%，確保土壤處于厭氧環境。WFPS計算方法如下：

式中：θw為土壤體積含水量(%)，θm為質量含水量，ρb為土壤容重；Tp為土壤總孔隙度(%)；ρm為土壤密度(g/cm3)。

設置10℃、20℃和30℃溫度條件，每個溫度下每個樣品3個重復，培養7天。同時，每個生物質炭處理設置18個樣品，其中9個不添加乙炔，用于測定氣體排放量，另外9個添加10%的乙炔作為平行抑制。具體步驟如下：用惰性氣體氦氣沖洗每個血清瓶3次，以排除瓶內空氣。同時制備用濃硫酸/蒸餾水過濾的乙炔氣體，向血清瓶中添加體積含量為10%的乙炔氣體，并立即抽取氦氣和乙炔測定作為0時刻背景值。分別于培養開始后的第0、8、16、24、36、48、54、72、96 h采集氣體樣品測定。抽取10 mL血清瓶中的氣體同時補充10 mL惰性氣體或10%乙炔，放于培養箱繼續培養。抽取氣體用于計算各處理土壤反硝化過程總脫氮量、N2產生量、N2O/(N2O+N2) 值[20]。試驗結束后，取出各血清瓶中土壤樣品，測定不同處理土壤的土壤微生物基因豐度、銨態氮()、硝態氮()、亞硝態氮()、土壤pH、土壤電導率(EC)和土壤可溶性有機碳。

1.3 土壤N2O、N2以及化學性質測定

1.3.1 N2O的分析 采用Agilent 7890A氣相色譜儀(安捷倫, 上海)，測定樣品中的N2O濃度，檢測器為ECD，載氣為體積分數5%氬甲烷，檢測溫度為300℃，并計算積累排放量：

式中：EN2o為N2O排放量(N mg/kg soil)，Fi為N2O排放通量 [N2O-N μg/(kg·h)]，n和i代表測量次數，(ti+1-ti)代表兩次鄰近測量時間(h)，1000為單位換算常數。

土壤N2含量為添加乙炔組與無乙炔組N2O含量之差，其計算公式如下：

1.3.2 土壤無機氮素測定 采集新鮮土樣過2 mm篩，稱取2 g土樣于塑料瓶中，加入50 mL 2 mol/L的KCl溶液浸提，濾液中的銨態氮測定采用靛酚藍比色法，硝態氮測定采用紫外分光光度法，亞硝態氮測定采用重氮化耦合比色法。比色過程采用紫外分光光度計(UV-2450, Shimadzu, 日本)。土壤pH使用精密pH計(PHS-3C型，上海)測定； EC采用水土比5∶1 (v/v)浸提土壤溶液，用電導率儀(Mettlertoledo，FE30-K，中國)進行測定；可溶性有機碳(DOC)采用水土比5∶1連續振蕩4 h浸提，浸提液過0.45 μm濾膜，用總有機碳(TOC)分析儀測定(TOC-VWP，日本島津)。所有土壤理化性質的測定方法均參考魯如坤《土壤農化分析》[19]。

1.3.3 土壤微生物總DNA提取 土壤DNA提取方法按照FastDNA Spin Kit for Soil (MP biomedicals,USA)試劑盒的操作手冊進行。提取后用微量紫外-可見光分光光度計(NanoDrop ND-2000c Technologies,Wilmington, DE)測定其濃度，初步判斷土壤微生物總 DNA 提取效果。隨后將提取成功的土壤 DNA 保存至–20℃條件下，待定量 PCR 擴增時再取出依次將濃度稀釋至20 ng/μL左右。在本測定過程中，細胞的裂解是在搖床(Biospec product, Wakenyaku, Co.,Tokyo, Japan)中以6 m/s的速度持續30 s進行的。目標基因豐度通過qPCR技術分析，使用TaqMan系統對累積的熒光進行實時檢測(BioRad, Laboratories Inc., Hercules, CA, USA)。反硝化功能基因熒光定量PCR反應體系為20 μL，其中包含10 μL的SYBR Premix Ex Taq? (含 TaKara Ex Taq HS, dNTP Mixture,Mg2+, Tli RNase H and SYBR Green I; Takara Bio Inc.,Japan)、0.2 μL 上游引物和下游引物，8.6 μL 超純水以及 1 μL 稀釋的 DNA 模版 (DNA 10～15 ng/μL)。每種基因對應的引物分別是nirK876C/nirK1040 (nirK)、Nirsed3aF/NirsR3cd (nirS)、nosZ2F/nosZ2R (nosZ)以及nosZ-II-F/nosZ-II-R (nosZII)[21]。

1.4 分析方法

數據的表示形式為平均值±標準差。所有數據使用Microsoft office EXCEL 2016、JMP 14 (Cary, NC,USA, 2007)和R 4.1.2進行處理與分析，使用JMP 14.0進行雙因素方差分析和多重比較(α = 0.05)，使用R 4.1.2的vegan 包進行冗余分析，使用MASS包進行逐步回歸分析。繪圖軟件為OriginPro 9.0和R 4.1.2的ggplot2包。

2 結果與分析

2.1 不同溫度條件下生物質炭對土壤N2O排放的影響

雙因素方差分析結果(圖1)顯示，溫度和生物質炭均顯著影響土壤N2O的排放量，溫度的效應(P＜0.001)高于生物質炭的效應 (P＜0.01)，并且二者之間存在交互效應(P＜0.001)。溫度升高顯著增加菜地土壤反硝化過程中N2O排放量，而在不同溫度條件下，FB和FAB的減排效果并不相同。如圖1所示，FAB處理的N2O排放量在10℃下顯著低于CK和FB，分別降低了21.0%和19.9%，CK和FB的排放量無顯著差異。20℃下3個生物質炭處理的N2O排放量無顯著差異。30℃下，FAB和FB處理的N2O排放量無顯著差異，但分別比CK顯著降低了22.3%和18.8%。若排除溫度因素，添加生物質炭處理平均降低了15.7%～16.1%的菜地土壤N2O排放量。

圖1 不同溫度條件各生物質炭處理 N2O、N2O +N2排放量以及N2O/(N2O+N2) 值Fig.1 N2O and N2O +N2 emission and N2O/(N2O+N2) ratio under different temperatures for different biochar treatments

在10℃培養條件下，96 h培養階段中N2O累積排放量始終很低，CK、FB、FAB處理沒有明顯的差異。20℃下N2O累積排放量隨培養時間的延長雖呈現FAB＞FB＞CK處理，但最終N2O累積排放量差異未超過N 10.2 mg/kg soil。30℃下，N2O累積排放量在培養54 h之前為FAB ＞FB ＞CK處理，培養結束時CK處理高于FAB和FB處理。

溫度和生物質炭均顯著影響總脫氮量(N2+N2O)，溫度對總脫氮量的效應(P＜0.001)高于生物質炭(P＜0.01)，并且二者之間存在交互效應(P＜0.001)。與CK相比，FB、FAB處理在培養溫度10℃和20℃下未降低總脫氮量，而在30℃時降低了總脫氮量，FB和FAB處理之間未出現顯著差異。此外，在CK處理中，土壤的N2O/(N2+N2O)值以20℃條件下最低，30℃最高；FB處理中，20℃條件下的N2O/(N2+N2O) 值遠低于10℃和30℃條件下，也低于同樣溫度下的CK和FAB處理；而在FAB處理中10℃的N2O/(N2+N2O) 值遠低于20℃和30℃條件下。表明新鮮生物質炭可以大幅減少在20℃時N2O的損失比，而陳化生物質炭可降低10℃時N2O在總脫氮量中的比例。

2.2 不同溫度條件下各生物質炭處理的土壤理化性質

表1 不同溫度條件下生物質炭處理的土壤理化性質Table 1 Physicochemical properties of soils under different temperature conditions for different biochar treatment

如表2所示，通過逐步回歸分析發現，各處理N2O排放量分別受到可溶性有機碳、和含量的影響，各擬合模型顯著(P＜0.01)。在CK處理中，N2O排放量主要受到可溶性有機碳含量的影響，可溶性有機碳含量的增加有利于N2O排放量的減少。與CK處理相比，施用生物質炭處理(FB和FAB)影響土壤N2O排放的機理有所不同。生物質炭處理主要通過影響土壤和含量介導土壤N2O排放，在FB處理中，N2O排放量主要受到含量的影響，而在FAB處理中，N2O排放量主要受到土壤和含量影響。

表2 土壤理化性質與N2O排放量 (F) 間的逐步回歸分析Table 2 Stepwise regression between N2O emission (F) and soil physicochemical properties

2.3 不同溫度下生物質炭對土壤反硝化功能基因豐度的影響

如圖2所示，由方差分析可知，溫度效應總體上并未顯著影響反硝化功能基因豐度，而生物質炭顯著影響了nirK基因豐度(P＜0.01)和nosZII基因豐度(P＜0.05)，且溫度與生物質炭對nirS基因豐度存在顯著交互效應。與不添加生物質炭CK相比，FAB處理的nirK基因豐度在20℃時顯著增加了1277.0%，在30℃時顯著增加了1193.4%，且在20℃和30℃時FAB處理的nirK基因豐度顯著高于FB處理(P＜0.05)；與CK處理相比，生物質炭的添加在10℃時顯著增加了nirS基因豐度(P＜0.05)，而在20℃和30℃時對nirS影響并不顯著；對于nosZ基因而言，雖然生物質炭對其豐度總體影響不顯著，但是在10℃時生物質炭顯著增加了nosZ基因豐度。另外，FAB處理在20℃、30℃時相較于CK處理分別顯著增加了nosZII基因豐度的814.4%和736.8% (P＜0.05)，而FB處理效果并不顯著。

圖2 不同溫度下各生物質炭處理土壤中反硝化功能基因豐度Fig.2 Abundance of denitrification functional genes in different biochar-treated soils at different temperatures

圖3 土壤理化性質與反硝化功能基因豐度的冗余分析Fig.3 Redundancy analysis of soil physicochemical properties and denitrification functional gene abundance

3 討論

3.1 溫度變化對集約化菜地土壤N2O排放的影響

本研究發現，溫度升高顯著增加了菜地土壤N2O 排放量 (圖1，P＜0.001)，這與前人[22–23]的研究結果一致。但增溫范圍在10℃～20℃時，土壤N2O的排放量增幅最大，其增幅達到613.6%～951.1%，是20℃～30℃增溫范圍的3倍左右，這表明在本研究中土壤N2O排放的增加并不隨著溫度上升而呈現線性增長模式。Xing等[24]研究同樣發現在15℃～25℃條件下土壤N2O排放更加劇烈，且溫度敏感性更高。這說明此溫度區間更適宜N2O的產生從而導致其劇烈排放。然而，在本研究中，我們未發現溫度對反硝化過程關鍵酶基因產生顯著影響。這可能是由于以下幾點原因造成：第一，nirK基因通常在低于0℃的環境中具有較高的溫度敏感性[24]，而本研究所設置的溫度區間并不在nirK基因的溫度敏感性區間上，這導致其未受溫度的顯著性影響。nirS基因通常在5℃～35℃下溫度敏感性較高[24]，不過因為其與nirK基因皆為亞硝酸鹽還原酶的功能基因，他們的豐度可能同時會受到其底物含量的影響。在本研究中，含量受溫度影響較弱，這可能限制了該類基因豐度發生顯著改變。第二，先前許多研究揭示了nosZ基因溫度敏感性的不一致[25–26]，這可能是由于nosZ基因在不同土壤環境中所導致的，其溫度敏感性需要進一步研究。第三，一些觀點認為溫度可能會促進土壤中可利用C含量和N的礦化，從而促進 N2O排放增加[22–23]。本研究中，溫度由 10℃增加至20℃時含量顯著增加了，這可能就是由于溫度升高提高了土壤的礦化速率所導致，這也間接增加了N2O排放風險。

3.2 生物質炭陳化對集約化菜地土壤 N2O排放的影響

本研究發現生物質炭處理在30℃時顯著降低了18.8%～22.3%的N2O排放量，且FAB在10℃顯著降低了21%的N2O排放量，溫度與生物質炭對 N2O排放存在交互效應(圖1，P＜0.001)。但排除溫度因素，添加生物質炭降低了菜地土壤15.7%～16.1%的N2O排放量。生物質炭能夠減少農田土壤 N2O排放的研究在先前皆有報道[12–13]。Liu等[27]通過薈萃分析評估208項研究，發現施用生物質炭減少了土壤32%的N2O排放，且隨著時間推移，FAB能夠進一步降低N2O的排放[27–29]。此外，在10℃時FAB處理顯著降低了 N2O排放量，而在30℃時FB和FAB處理均可以顯著降低 N2O排放量(圖1，P＜0.05)，這表明不同種類生物質炭在不同溫度條件下對N2O減排能力存在差異。其主要原因有以下幾點：第一，研究表明生物質炭的“石灰效應”可以通過影響土壤理化性質和微生物活性而介導N2O的排放[30]，而土壤pH的升高有助于N2O轉化為N2，從而降低N2O的排放[31–32]。本研究中，生物質炭處理(FB和FAB)提高了土壤pH，并且經過冗余分析發現，pH是影響反硝化功能基因豐度的重要理化因素，這說明了生物質炭的“石灰效應”可能是通過影響反硝化功能基因豐度間接影響反硝化過程。此外，FAB處理較FB處理能更顯著提高土壤pH (表1，P＜0.05)，這可能導致了FAB處理顯著增加了nirK和nosZII基因豐度，從而使FAB處理減排效果優于FB處理。第二，雖然FAB處理的含量最高，但相比于其他處理其N2O排放最低(表1，圖1)。這表明FAB處理能減少N2O排放，但是其可能是通過促使土壤中氮素以NO的形式損失這一途徑，從而減少N2O排放。本研究中，FAB處理顯著增加了nirK基因豐度(圖2)，nirK基因是控制轉化為NO的關鍵基因，這可能會在較高溫度時促使大量的NO產生。由于土壤中反硝化過程亦是NO排放的主要來源[33–34]，其大量排放可能會使氮素以NO而不是N2O的形式損失。有一些研究發現高濃度的NO會抑制反硝化過程中NO向N2O的轉化[35]，這亦可能會導致土壤中 N2O排放進一步降低。此外，能在反硝化過程中被還原為，也會間接促進NO的產生。第三，FAB處理可能會促進反硝化過程N2O向N2的轉化，從而減少 N2O排放。本試驗中生物質炭添加能顯著增加nosZII的基因豐度，且FAB處理在較高溫度下相比CK和FB顯著增加了nosZII基因豐度(圖2，P＜0.05)，這與FAB處理 N2O排放量最低的結果[36–39]一致。第四，施加生物質炭與不施加生物質炭處理在影響土壤反硝化過程的理化因素方面具有差異(表2)。在CK處理中，N2O排放量主要受土壤可溶性有機碳含量影響(P＜0.01)，其原因可能是施用氮肥導致土壤中氮源增加，土壤C/N發生改變，此時反硝化過程將受到土壤碳源的制約，而碳源通常會作為反硝化過程的電子供體[40]。在添加生物質炭處理中，FB表面通常具有一些可被生物利用的碳源[41]，而生物質炭在田間陳化過程會在表面形成一層有機無機復合體[42]，這層有機無機復合體也能為土壤提供一定的碳源。因此在施加生物質炭處理中，反硝化過程受到碳源的制約較弱，而主要受到氮源的影響。第五，由于新鮮生物質炭疏松多孔的表面，可在孔隙中吸附[43]，這可能導致土壤中持留量增加，但減少了參與反硝化過程的量，從而降低N2O排放。

在本研究中，生物質炭在30℃下顯著降低了(N2O+N2)，即總脫氮量，但是未顯著影響N2O/(N2O+N2)值(圖1)。Lan等[43]研究發現，施加生物質炭后土壤雖然減少了N2O排放但是并未影響N2O/(N2O+N2)，其認為是由于未出現N2O向N2的轉化導致，但是其也指出乙炔抑制法存在對N2定量評估產生偏差的缺陷。綜合本研究結果，我們認為更可能是由于乙炔抑制法缺陷導致了N2O/(N2O+N2)值變化并不顯著。但是，上述現象并沒有在10℃條件下有所體現，這可能是由于在較低溫度時微生物活動不夠強烈。FAB的減排能力可能與微生物活動更加相關。

此外，本研究結果也很好的解釋了在與本試驗相關田間試驗中出現的現象，即生物質炭在高于20℃條件下能夠更有效地降低土壤 N2O排放這一結果[10]。郭凡婧等[44]對不同利用類型土壤施加生物質炭的N2O減排效應進行了總結，結果其減排機理和程度并不一致。此外，Lan等[45]在灰土土壤的田間試驗結果證明，nosZ基因豐度是影響N2O排放的關鍵，而Duan等[46]在兩種蔬菜地土壤的室內培養試驗結果則表明，生物質炭對不同類型土壤中反硝化功能基因的影響不同。以上結果表明，即使生物質炭在不同試驗中均體現出對土壤N2O的減排效應，但其隨時間的陳化在華南赤紅壤土壤中對N2O減排機制有所不同，其微生物學機制需要進一步探索研究。

4 結論

溫度升高會顯著提高菜地土壤中N2O排放量，但是這一過程并不是簡單的線性增長，而以10℃增加至20℃時排放增幅最大。生物質炭的減排能力與微生物活動相關，因此生物質炭在較高溫度下的減排效果更好。

新鮮與陳化生物質炭的減排機制不同。新鮮生物質炭主要通過持留減少其參與反硝化過程減少N2O排放。而陳化生物質炭不僅通過提高土壤pH改變土壤環境及微生物數量影響反硝化過程，還通過對nirK基因豐度、和含量的影響，促進反硝化過程中的氮素以中間產物NO形式損失，并且能通過影響nosZII基因豐度促進N2O向N2的轉化，減少反硝化N2O的產生。因此，陳化生物質炭的N2O減排效果優于新鮮生物質炭。