基于萬古霉素熒光探針的原位標記及應用

黃亞妮 陳代杰 殷瑜,*

(1 上海師范大學生命科學學院，上海 200030；2 上海交通大學藥學院，上海 200240)

病原菌一直是人類健康的主要威脅。傳染病每年造成大約100萬人死亡，占全球死亡率的三分之一[1]。而隨著抗生素的不斷使用，耐藥菌不斷出現[2]。因此，快速精確診斷病原菌、尋找新的抗生素，并對抗生素的作用機制以及細菌與人體相互作用機制的研究迫在眉睫。熒光抗生素探針作為一種新的研究工具，使得藥物及其與細菌靶點的相互作用能夠在細胞器、細胞及動物水平中被示蹤[3]。萬古霉素是由東方擬無枝酸菌產生的含七肽的糖肽類抗生素，可有效與細菌細胞壁中的D-丙氨酰-D-丙氨酸部分特異性結合，能特異性地抗革蘭陽性菌，是臨床上治療由金黃色葡萄球菌引起的嚴重感染的首選藥物[4]。萬古霉素已在臨床上應用了50多年，對其藥代動力學、生物分布和毒性特征有著廣泛的了解。從結構上看，萬古霉素具有與熒光劑共價結合的伯胺基團，從而可形成熒光探針，作為光學成像劑在體內選擇性靶向革蘭陽性菌。本文將對熒光標記萬古霉素技術及其在細菌臨床感染診斷、藥物作用機制研究、藥效研究等方面的應用進行綜述。

1 熒光標記萬古霉素技術

理想的熒光標記的抗生素不應改變與細胞靶點的結合或藥物的藥動學，因此熒光標記試劑的選擇至關重要。

1.1 FITC標記萬古霉素

異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)是一種量子產率高的熒光染料。其最大激發/發射波長在492/525 nm左右。當分子中含有化學反應活潑的異硫氰基(-NCS)時，在適當條件下，它易與蛋白質氨基酸的N端殘基形成共價鍵[5-7]。用FITC標記萬古霉素，可獲得既能保持FITC熒光特性、又能保持萬古霉素與細菌胞壁結合能力的標志物。類似異硫氰酸的熒光素還有羥基熒光素(craboxyfluorescein,FAM)，四氯熒光素(tetrachlorofluorescein,TET)。但熒光素類衍生物有共同的缺點：光淬滅率高、pH敏感性強和發射波譜寬等[8-9]。

1.2 羅丹明類熒光試劑

羅丹明類是一種標準熒光素的衍生物，主要包括R101、四乙基羅丹明(RB200)和羧基四甲基羅丹明(craboxytetramethylrhodamime,TAMRA)等，其結構中的-SO2X、-NCS為活性基團。萬古霉素與羅丹明的標記反應中，羅丹明的活性基團與萬古霉素C端羧基結合[10]。與FITC等熒光素類衍生物相比，羅丹明類熒光素具有更強的光穩定性、更高的熒光產量及更低的pH敏感性。

1.3 硼二吡咯甲基乙烷

硼二吡咯甲基乙烷(BODIPY)是最常用的熒光染料。BODIPY的光譜峰寬較窄，檢測靈敏度高，其光穩定性能十分優越，而且該染料在水溶液中溶解度較高，在水中不易被淬滅。萬古霉素和BODIPY的熒光素衍生物已被用于研究枯草芽孢桿菌中肽聚糖的生物合成過程[11]。

1.4 熒光無機納米顆粒

近年來，熒光無機納米顆粒由于克服了熒光試劑不穩定、容易淬滅等缺點，得到了廣泛的關注。Sun等[12]采用兩步法制備了萬古霉素和對苯二甲酸酯(TA)共修飾的摻雜銪的雙氫氧化物(Van-TA-Eu-LDHs)納米顆粒，可以選擇性地熒光標記細菌。Zhang等[13]用一種紅色染料(DyLightTM)標記了萬古霉素明膠納米球，其生物相容性、生物降解性和分析靈敏度比傳統的萬古霉素熒光標記法具有很大的優勢。納米熒光具有激發光譜寬、分布連續、發射光譜對稱分布且寬度窄、顏色可調等優點。萬古霉素的熒光納米顆粒在生物分子標記、細胞成像等生物領域有著廣泛的應用前景。

1.5 其他熒光物質

IRDYE800CW熒光素是一種近紅外熒光染料，與萬古霉素糖基上的-NH2結合為一種熒光探針，具有極為顯著的穿透深度和分辨率，因此該熒光標記物可用于生物熒光成像技術，在探尋細菌感染診斷等方面具有重要的實踐意義和應用前景[14]。二苯甲酮光交聯劑作為一種熒光劑可與萬古霉素游離的C端羧基結合成為一種新型探針[15]，其價格低廉，在常用溶劑中溶解性較好，最大吸收波長和中壓汞燈的發射波長匹配，但是熔點較低，在升溫時容易因揮發而造成損失[16-17]，該探針可用于萬古霉素作用機制的研究。

熒光試劑的種類不同，標記方法各有差別，但所要求的條件和步驟大致相同。影響標記的因素有溫度、pH值及反應液中熒光試劑比例等。以上幾種熒光試劑標記方法的比較見表1。

表1 萬古霉素熒光標記方法的比較Tab.1 Comparison of fluorescent labeling methods forvancomycin

2 萬古霉素熒光探針的應用

熒光萬古霉素已用于病原菌的檢測、細胞壁合成機制、毒性、和藥效學研究等方面[3](圖1)。

圖1 熒光標記萬古霉素及其應用Fig.1 Fluorescent labeling of vancomycin and its applications

2.1 細菌感染的檢測

病原菌的診斷和耐藥菌的檢測對臨床用藥具有重要的指導意義。傳統的細菌檢測方法，如培養基培養技術、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)和聚合酶鏈反應(PCR)分析等，存在耗時長、靈敏度低、過程繁瑣等缺點，需要密集細致的樣品制備和熟練的技術人員[18]。如今放射性核素成像技術已經成為檢測細菌感染的成像主要手段，但其主要的問題是無法區別細菌的類型以及無法排除炎癥的影響[19-20]，為細菌感染的體內成像開發特定的成像探針可有效解決這些問題[21-23]。

2.1.1 體內病原菌的快速診斷

細菌的快速分型(革蘭陽性菌或革蘭陰性菌)是臨床選擇抗生素種類的重要依據。熒光標記抗生素作為一種簡單且易于控制的方法，已成為許多生物學研究中不可或缺的工具，可以對細菌進行簡單、快速、靈敏和選擇性的鑒定[21]。Yang等[10]設計了一種萬古霉素和羅丹明修飾肽衍生物(Rho-FF-Van)作為熒光顯像劑，隨后，將耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcus aureus,MRSA)與探針共培養后通過透射電鏡可觀察到Rho-FF-Van處理的MRSA外膜有明顯的納米聚集體。利用患有肌炎的小鼠，往其左后腿上注射MRSA，右后腿上注射Escherichia coli，注射熒光萬古霉素后2 h內，熒光成像觀察，發現Rho-FF-Van在MRSA感染的大腿肌肉中的蓄積量是E.coli感染的8.7倍(圖2a)，與對照組織相比，感染MRSA的大腿肌肉中Rho-FF-Van的蓄積量增加了3.9倍(圖2b)。證明了萬古霉素對小鼠體內革蘭陽性菌MRSA的作用更敏感。Van Oosten等[14]也證明用IRDYE800CW標記的萬古霉素，在小鼠大腿肌肉中可區分革蘭陽性菌S.aureus的和革蘭陰性菌E.coli的感染(圖2c)。在人的尸體中，將S.aureus注入皮下，隨后，注射熒光萬古霉素成像。同樣可以明顯識別出含有熒光細菌的斑點(圖2d)。由此可見，萬古霉素熒光探針可有效用于病原菌的原位標記及快速診斷。

圖2 萬古霉素熒光標記化合物在動物中的成像Fig.2 Image of vancomycin fluorescently labeled compounds in animals

2.1.2 萬古霉素耐藥菌的檢測

對于菌株對萬古霉素敏感性的檢測，傳統方法有稀釋涂布平板法和PCR擴增等，這些方法耗時長，不適用于大量樣本的檢測。本實驗室前期采用FITC標記的萬古霉素，通過熒光分光光度計和流式細胞儀(FCM)法，建立了菌株對萬古霉素耐藥性的快速檢測方法。結果顯示萬古霉素熒光標記物對其敏感菌(Enterococcus faecalis,S.aureus)表現出很強的特異性，其熒光強度明顯高于對萬古霉素不敏感的細菌如革蘭陰性菌E.coli和耐萬古霉素腸球菌(VRE)，該探針可用于檢測細菌對萬古霉素的耐受性[24]。

2.2 萬古霉素給藥系統的改善

生物材料相關感染和骨髓炎等感染通常與細菌(如S.aureus)的存活有關。由于許多抗生素的體內效力較低，治療這些感染仍然是一個主要的挑戰。因此，迫切需要局部給藥系統，以提高抗生素的細胞內給藥效果[25-26]。

將熒光標記的萬古霉素明膠納米微球懸浮液注射到斑馬魚幼體的尾肌組織中[13]，24 h后，在體內和體外均能觀察到巨噬細胞對萬古霉素明膠納米微球的內化作用。而注射無明膠納米球載體的游離萬古霉素后，萬古霉素和斑馬魚巨噬細胞幾乎沒有發生內化作用。結果顯示，明膠納米球作為萬古霉素的載體，可以提高萬古霉素的局部給藥能力，增強萬古霉素的抗菌活性。

2.3 作用機制的研究

2.3.1 萬古霉素及其衍生物作用靶點的研究

萬古霉素已在臨床上應用了50多年，但是萬古霉素及其類似物的作用靶點仍有一些未知。熒光標記萬古霉素藥物可以直接與細菌靶點相互作用，觀察方便，有利于萬古霉素的作用機制進一步研究。

為了深入了解萬古霉素對S.aureus和E.faecalis作用的相關靶點，Eirich等[15]用二苯甲酮光交聯劑與萬古霉素結合成小分子的光親和探針。用不同濃度的探針處理細菌，裂解細菌后通過熒光SDS凝膠，進行蛋白質組分析，發現了兩個先前未知的萬古霉素作用靶點葡萄球菌自溶素(ATL)和ABC轉運體蛋白，萬古霉素可直接靶向葡萄球菌自溶素(ATL)酰胺酶的結構域，導致S.aureus細胞壁被破壞，同時也增強了金黃色葡萄球菌對低濃度萬古霉素的耐受性。此外，在E.faecalis中，萬古霉素光可與ABC轉運體蛋白特異性結合，從而阻礙細菌對糖和肽等必需營養素的攝取。

2.3.2 肽聚糖生物合成的機制研究

細菌細胞周圍的肽聚糖(PG)層在決定細胞形狀方面起著重要作用。PG的合成涉及細菌肌動蛋白同源物(如在細胞內形成螺旋電纜的Mbl)和細胞外多蛋白復合物(如青霉素結合蛋白)之間的相互作用，而何時何地、如何調控，機制尚不清楚。采用熒光素標記的萬古霉素探針(Van-FL)與PG前體結合，并以作用于細菌轉肽酶的雷莫拉寧熒光素探針(Ram-FL)作為對照，比較了在枯草芽孢桿菌中觀察到的兩種PG結合熒光抗生素的染色模式[27]。結果顯示雷莫拉寧和萬古霉素探針沿著枯草芽孢桿菌細胞壁產生螺旋狀染色圖案，證明PG是以螺旋狀的方式合成的。

2.3.3 細菌對萬古霉素耐藥機制的研究

利用熒光標記的萬古霉素(BODIPY-FL-萬古霉素)可以發現，在使用萬古霉素治療期間獲得的分離菌株，對萬古霉素敏感性降低與細菌的藥物結合力增加、細胞壁周轉率降低以及Triton X-100自溶敏感性降低直接相關[11]。這支持了萬古霉素中度耐藥性金黃色葡萄球菌(VISA)表型在體內發展的概念，即細菌通過細胞壁的增厚建立了“抗生素捕捉”機制，最終阻止萬古霉素擴散，使細菌產生耐藥性。

2.3.4 清除生物膜作用機制的研究

S.aureus除了是引起感染的主要致病微生物之一外，大部分由S.aureus導致的感染與細菌生物膜的形成有關。生物膜是密集的微生物群落，附著在有生命或無生命物體表面，并進一步分泌主要由水、多糖和蛋白質組成的胞外基質，生物膜的形成會使細菌發生生理變化，導致生物膜內的菌體出現耐藥性[28-29]。

研究發現，利福平與萬古霉素聯用，具有協同清除生物膜的作用。利用BODIPY-FL-萬古霉素熒光標記物通過熒光漂白后恢復技術(FPAP)，可在共聚焦顯微鏡下動態觀察熒光抗生素在S.aureus生物膜內的滲透率[30]。研究結果顯示，單獨用萬古霉素和利福平治療時，細胞損傷率較低。當利福平與萬古霉素聯用時，隨著時間的推移，細胞損傷明顯增加。同時發現二者聯用時，熒光萬古霉素與利福平相互作用形成復合物，并能快速滲透入生物膜，使兩種藥物與各自靶點結合，協同致死菌膜內的菌體，從而清除生物膜。

3 總結與展望

過去的幾十年中靶向成像在癌癥治療中相對成功，但細菌感染靶向成像探針的開發研究很少，目前還沒有針對性的細菌成像方法用于臨床常規診斷，而利用熒光進行標記分析的發展特點是趨于更簡便、更靈敏、更穩定、更安全以及更好的選擇性等。

熒光抗生素探針的研發，可以用于耐藥菌的快速檢測，進一步用于耐藥細菌的機制研究和不同細菌的敏感性測試，并且指導抗生素合理的使用，以解決如今日益嚴重的細菌耐藥性問題。未來的熒光標記技術也會克服如今存在的一些潛在的局限性，例如穩定性低、低深度穿透和不可避免的組織自熒光。