高毒力肺炎克雷伯菌實驗室鑒定方法的研究進展

鄭茂 袁成良 鄂建飛 鄒玉

(1 德陽市人民醫院檢驗科，德陽 618000；2 德陽市人民醫院輸血科，德陽 618000)

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)是引起醫院獲得性感染和社區獲得性感染的重要潛在病原體，也是近年來腸桿菌目中僅次于大腸埃希菌的第二大條件致病菌。20世紀80年代，首次報道肺炎克雷伯菌的一個新變種，引發無膽道疾病的患者發生侵襲性肝膿腫，并伴有轉移性眼內炎，該變種被定義為高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulentKlebsiella pneumoniae,hvKP)，此后世界范圍內相繼報道類似感染病例，在中國、新加坡、韓國、日本等亞太地區尤為常見，成為一種公共衛生安全的新威脅[1]。與引起醫院獲得性感染的經典肺炎克雷伯菌(classicKlebsiella pneumoniae,cKP)不同，hvKP的典型特征是傾向于感染無基礎疾病的年輕機體，導致肝膿腫、肺炎、眼內炎、腦膜炎等嚴重疾病，亦可繼發遷徙性播散而出現多器官癥狀，嚴重者甚至危及生命[2-3]。令人擔憂的是，相關研究數據顯示hvKP的流行病學發生了重大轉變，可能正在取代cKP成為醫院和醫療保健相關感染的主要致病類型[4]。傳統觀點認為，肺炎克雷伯菌的高毒力和多重耐藥在基因組上幾乎沒有重疊，故大部分hvKP對除氨芐西林外的常用抗生素都保持高度敏感[5]。然而，隨著抗生素的不斷選擇以及耐藥質粒的傳播，hvKP耐藥率呈連年升高趨勢，甚至出現碳青霉烯類耐藥株(carbpenemresistant hypervirulentKlebsiella pneumoniae，CRhvKP)，給臨床抗感染治療帶來極大阻礙[6-7]。

盡管有大量與hvKP相關的文獻報道，但國際上仍無統一的hvKP定義標準[8]。已報道的研究使用各種評價標準，如拉絲試驗陽性、特定的莢膜血清型或毒力基因，亦有基于臨床表現結合病原菌分離來定義hvKP[9]。這使得不同研究數據之間可能難以解釋和比較。基于流行病學分析和感染的快速診斷等多方需求，目前迫切需要關于hvKP的準確表征或客觀鑒定方法，為此，本文就hvKP的實驗室鑒定方法進行如下綜述。

1 hvKP的表型鑒定

1.1 高黏性表型

hvKP常表現為高黏性表型，即菌落在血平板上生長呈高黏液性，這種高黏性能是hvKP抵抗中性粒細胞吞噬和宿主細胞免疫殺傷的物質基礎，與其高毒力特征密切相關。因此，在某些較早文獻中hvKP又被稱為高黏液性肺炎克雷伯菌(hypermucoviscousKlebsiella pneumoniae，hmKP)。高黏性表型可通過黏液拉絲試驗(string test)來初步判斷，將菌株接種于血瓊脂平板，37℃培養16～18 h，用接種環輕柔向上挑起菌落，重復兩次，若挑起的黏液絲長度≥5 mm，即為拉絲試驗陽性，稱菌株為高黏性表型。拉絲試驗是一種半定量試驗，無需特殊儀器，操作簡便，結果易于判斷，故以往研究常將拉絲試驗作為hvKP的篩選試驗。

Tan等[10]研究發現在鑒定與原發性肝膿腫相關的肺炎克雷伯菌菌血癥分離株中，拉絲試驗重復性超過95%，根據拉絲長度截斷值不同(5、10和15mm)，靈敏度和特異度分別介于66%～90%、64%～67%，但是陽性預測值小于35%。另一項來自日本的橫斷面研究顯示[11]，采用拉絲試驗鑒定引起血流感染的hvKP，靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為69.2%、89.5%、60.0%和92.7%。由此可見，拉絲試驗雖然操作簡單，但鑒定hvKP的陽性預測值卻不高，可能造成hvKP漏檢，給臨床感染控制帶來困難，尤其不適合作為hvKP低流行地區的確定性試驗。隨著研究深入，新的證據表明高黏性和高毒力是肺炎克雷伯菌兩種不同的表型，雖然有很多相似之處卻不能完全等同，即hvKP不一定具有高黏性，高黏液性肺炎克雷伯菌也不一定具有高毒力[12]。所以僅憑拉絲試驗陽性來鑒定hvKP并不十分可靠，有必要識別高毒力表型背后的遺傳決定因素，以開發有效的方法來快速鑒定hvKP。

1.2 高毒力莢膜血清型

莢膜多糖既是肺炎克雷伯菌重要的抗原物質，也是其主要的毒力因子。根據莢膜多糖結構及抗原性不同，可將肺炎克雷伯菌分為至少82個莢膜血清型，其中K1、K2、K5、K20、K54和K57攜帶多種毒力基因，與各種侵襲性感染密切相關，是hvKP常見的高毒力血清型[13]。根據比較莢膜多糖合成基因的序列差異，以特異性區域設計引物靶點，通過PCR擴增技術確定高毒力血清型，可以初步篩選出hvKP。多位點序列分型(multilocus sequence typing，MLST)是通過PCR擴增多個管家基因的核苷酸序列，結果以序列分型ST表示，常用于分析肺炎克雷伯菌菌株間的變異及流行特征。

K1、K2血清型是引起肝膿腫的主要高毒力血清型，也是臨床上最常見的hvKP血清型[14]。hvKP不同ST分型與血清型存在較強相關性，ST23常存在于K1血清型，ST29、ST65、ST86和ST375常存在于K2血清型[15]。

針對K1血清型hvKP，浙江大學張嶸教授團隊[16]報道了一種可以進行快速鑒定的方法，該方法利用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)，通過測試遺傳算法(GA)、支持向量機算法(SVM)、監督神經網絡算法(SNN)和快速分類算法(QC)，對K1血清型和非K1血清型菌株進行區分，其中SVM算法最為可靠，其鑒定準確率超過90.0%。

針對K2血清型hvKP，Bialek-Davenet等[17]設計了一種多重PCR方法來鑒定其常見的克隆序列，包括ST86、ST380、ST679、ST65和ST375，多重PCR分析將有助于更好地確定新出現的肺炎克雷伯菌毒力克隆的流行病學。

由于肺炎克雷伯菌碳青霉烯類耐藥株和高毒力株，可能具有交叉傳播性，能夠在醫院和社區造成嚴重感染。應對這個新出現的問題，Yu等[18]設計了3種多重PCR方法，能夠準確區分CR-hvKP的ST258、ST11型菌株和hvKP的ST23、ST65、ST375、ST86型菌株，還可檢測K1、K2、K位點47(KL47)和KL64莢膜血清型。該方法可作為CR-hvKP和hvKP分子監測的有效工具，以識別和跟蹤這些菌株的傳播，提供及時的感染控制信息。

除PCR方法外，Siu等[19]還研發一種基于膠體金的新型免疫層析條(immunochromatographic strip，ICS)，含有抗莢膜多糖抗原的多克隆抗體，能夠特異性鑒定K1、K2血清型hvKP。ICS簡單快速，不需要熟練的操作人員或專用設備，且檢出限達到105CFU，室溫下儲存穩定6個月，可作為篩選大量樣本(如流行病學研究)的快速工具。ICS還能在5 min內直接檢測膿液引流樣本或血培養陽性樣本中的K1、K2血清型hvKP，鑒定準確性可與PCR方法相媲美[20]。

2 hvKP的毒力基因鑒定

2.1 毒力基因概況

與hvKP毒力相關的基因有很多，主要涉及莢膜多糖、菌毛、鐵載體等方面。黏液表型調節基因A(regulator of mucoid phenotypegene A，rmpA)/rmpA2和黏液相關基因A(mucoviscosity-associated gene A，magA)調控莢膜多糖合成，使hvKP具有抵抗細胞吞噬的能力，是hvKP重要的毒力因子，常作為鑒定hvKP的標志基因。細菌通過菌毛介導與宿主細胞接觸或黏附于黏膜表面，hvKP的黏附相關因子主要包括I型、III型菌毛，分別由fim、mrk基因調控。鐵是細菌生長繁殖最基本的營養元素，hvKP只有通過額外分泌鐵載體才能從宿主體內獲取鐵，鐵載體主要有腸桿菌素(enterobactin)、耶爾森菌素(yersiniabactin)、沙門菌素(salmochelin)和氣桿菌素(aerobactin)，與此相關的重要調控基因包括iroBCDN(沙門菌素生物合成)，iucABCD(氣桿菌素生物合成)和iutA(氣桿菌素轉運蛋白)。Russo等[21-22]首次證實在hvKP的4種鐵載體中，氣桿菌素可以明顯提高hvKP在體內外模型中的存活率，是介導hvKP毒力的關鍵因子。氣桿菌素合成蛋白是hvKP最有前途的抗毒靶點，有望開發出新型hvKP抗菌劑[23]。由于氣桿菌素常表達于hvKP，其相關生物合成基因簇iucABCD和轉運蛋白編碼基因iutA成為鑒定hvKP的重要指標[24]。

近年來，一些新的hvKP毒力基因不斷被發現。2017年，Bulger等[25]報道一種新的毒力因子：peg344，它存在于hvKP毒力質粒上并廣泛流行，相關動物實驗顯示，hvKP攻擊肺部后需要peg344才具有完全毒力，而攻擊皮下則不需要，表明peg344是一種內膜轉運蛋白。2018年，Palacios等[26]研究發現兩種新的hvKP毒力調節因子：kvrA和kvrB，并證實它們通過調控hvKP莢膜的表達從而影響菌株毒力。這些研究成果擴展了研究者對hvKP毒力因子的認識，也為鑒定hvKP奠定下基礎。

2.2 多重PCR鑒定毒力基因

與常規PCR相比，多重PCR在檢測毒力基因和血清型上更有連續性且快速，使其能夠便捷、有效地對臨床樣本進行實驗室檢測，常在研究中用于鑒定hvKP。雖然hvKP眾多的毒力因子攜帶率均處于高水平，但尚未找到某一個標志物能獨立代表高毒力菌株，故有學者提出hvKP的生物學標志可能是幾種毒力因子的組合。

為了探索高診斷性能的基因型或表型生物學標志，Russo等[27]納入來自北美及英國的hvKP、cKP臨床分離株，使用流行病學和動物模型對這些分離株的多個關鍵基因型標記物進行評估。該研究結果顯示peg344、iroB、iucA、rmpA和rmpA2在鑒定hvKP方面，診斷準確度大于95%；小鼠膿毒癥模型中，這5種基因與嚴重疾病或死亡的風險比均大于25。若將peg344和iucA組合應用，則可將鑒定準確性提高至98%。此外，定量鐵載體的產生量≥30 μg/mL也可用于hvKP的預測，準確度為96%，并顯示出與嚴重疾病或死亡的風險比為31.7，表明定量鐵載體溶液測定法具有極佳的鑒定性能，盡管尚無法在實驗室中進行直接測量，但相信將來很有可能得到發展和應用。徐水寶等[28]研究也發現rmpA2、magA、fimH、aero、iutA、kfuBC可作為hvKP的分子標志物，尤其iutA診斷效能最高。這些數據有力地支持了毒力基因用于鑒定hvKP的高準確性，有助于開發出更多的快速多重PCR檢測手段。

盡管拉絲試驗曾被作為鑒定hvKP的常用方法，但如今的研究多以hvKP的毒力基因作為鑒定分子標志物，或以拉絲試驗與毒力基因組合應用，并逐漸被學術界所認可。筆者將近年來文獻報道的多重PCR方法鑒定hvKP進行總結，如表1所示，可以看出，以一種或多種毒力基因組合作為hvKP鑒定方法已成為研究趨勢。

表1 近年來文獻中關于hvKP的定義標準Tab.1 Standards of hvKP in literatures in recent years

2.3 環介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplication，LAMP)鑒定毒力基因

環介導等溫擴增技術是在單一恒定溫度下使用4～6個引物，通過鏈置換DNA聚合酶快速擴增獲取新DNA的一種方法。Liao等[41]利用LAMP識別peg344基因靶位，建立了hvKP的快速分子診斷方法。該團隊所設計的LAMP能在65℃下特異性地將hvKP和cKP區分開，60 min內即可完成檢測，靈敏度是普通PCR方法的100倍，而且檢測到的hvKP毒力表型與小鼠致死率試驗及血清殺傷試驗一樣精確。LAMP擴增過程不需要熱循環儀，也不需要電泳即可觀察到擴增產物，操作簡便、快速，可用于實驗室常規鑒別hvKP和cKP。以peg344基因為靶點的LAMP，極有可能將成為欠發達地區開展hvKP流行病學調查的有力工具。

2.4 MALDI-TOF MS技術鑒定毒力基因

MALDI-TOF MS作為一種新型的軟電離生物質譜，具有快速、準確及高通量等強大優勢，已成為一項高效的微生物快速鑒定技術，逐漸應用于臨床微生物實驗室。與此同時，該技術在鑒定hvKP毒力基因方面也引起學者們的關注。孫巧玲等[42]研究證實MALDI-TOF MS可以快速區分攜帶rmpA2毒力基因的hvKP，靈敏度和特異度都在90%以上。值得注意的是，MALDI-TOF MS為快速檢測hvKP毒力基因方面提供了思路，但仍需展開進一步臨床驗證。

2.5 毒力質粒鑒定

隨著基因測序技術的廣泛應用，宏基因組測序結果顯示大部分hvKP都攜帶一個約220kb大小的質粒(pLVPK)，或這個質粒的一部分(pLVPK-like)。通常pLVPK質粒包含4個主要毒力基因(iucA、rmpA、rmpA2、iroN)，若這4個基因全部檢出，說明菌株攜帶完整的pLVPK質粒；若只是部分檢出，說明菌株攜帶的pLVPK-like質粒。Struve等[43]研究中檢測到的所有hvKP克隆譜系均含有pLVPK質粒，該質粒具有高度保守性，編碼氣桿菌素、沙門菌素以及rmpA2，表明毒力質粒在hvKP致病中發揮重要作用。因此，有文獻將pLVPK質粒作為鑒定hvKP的生物學標志[44]。

毒力質粒在推動hvKP耐藥性的快速傳播方面也發揮著關鍵作用。Gu等[45]報道了浙江某大型醫院重癥監護病房暴發由CR-hvKP引起的呼吸機相關肺炎，測序結果顯示所有的CR-hvKP均屬同一個ST11型克隆株，這些CR-hvKP出現是因為ST11型CR-KP菌株獲得pLVPK-like毒力質粒。毒力質粒幾乎都攜帶數個毒力基因，在鑒定hvKP方面具有獨特優勢，但由于需要對菌株進行基因組測序，價格昂貴，難以在普通實驗室廣泛開展，目前多應用在科研或疑難菌株鑒定方面。

3 hvKP的毒力評估

3.1 抗中性粒細胞吞噬試驗

中性粒細胞吞噬在機體抗細菌感染的先天性免疫反應中發揮重要作用，莢膜多糖使肺炎克雷伯菌能夠對抗中性粒細胞的吞噬作用，并介導菌體逃避或抵抗宿主的免疫殺傷。吞噬和胞外誘捕網(neutrophil extracellular traps，NETs)是中性粒細胞的胞內和胞外抗菌機制，而hvKP在抵抗中性粒細胞介導的吞噬及細胞內殺傷的能力均明顯強于cKP，還能抵抗中性粒細胞產生的NETs捕獲作用[46]。舒玲斌等[47]研究顯示抗中性粒細胞吞噬試驗耗時短，成本低，結果易于判斷，是判斷hvKP毒力的簡單有效方法。因此，抗中性粒細胞吞噬試驗作為衡量hvKP毒力的重要標準之一，可作為鑒定hvKP的輔助方法。

3.2 動物感染模型

動物感染模型最大的優點是可以直觀地表現出細菌毒力的大小，因此被廣泛用于評估病原體的毒力。hvKP因具有獨特的表型以及攜帶多種毒力基因，毒力往往很強，少量細菌即可造成小鼠死亡，半數致死量(LD50)多在1×103以下。然而，此類動物模型成本昂貴，試驗周期長，且需要使用生物安全2級設施，所以并不適用于大規模檢測。大蠟螟是近20年中開發的高通量動物模型，其幼蟲成本低廉，易于獲得，可以在較寬溫度范圍內飼養，是評估肺炎克雷伯菌毒力相關因素的有效模型，在菌液接種12h后即可進行毒力的檢測[48]。Shi等[49]研究還證實大蠟螟感染模型的LD50適合驗證hvKP的毒力水平，評價效果準確。因此，大蠟螟感染模型在越來越多的研究中被用于評估hvKP的毒力。

然而，Russo等[50]最新研究發現遠交小鼠感染模型對于區分hvKP和cKP非常準確，但在大蠟螟感染模型中觀察到hvKP和cKP毒力的顯著重疊，表明大蠟螟感染模型還不能完全準確區分hvKP和cKP。為了提高鑒定準確性，Li等[51]采用大蠟螟毒力試驗與拉絲試驗相結合的方式來鑒別hvKP和cKP，靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值均明顯高于僅用大蠟螟毒力試驗獲得的值。可以看出，采用大蠟螟毒力試驗與拉絲試驗相結合是一種相對簡便、準確鑒別hvKP和cKP的方法。

4 結語

目前，hvKP的感染病例早已從最初的亞洲地區蔓延至全球范圍，針對hvKP的研究也有長足進步，但仍無絕對特異性的鑒定指標，通常還是基于hvKP的獨特表型和基因型這兩個方面做出判斷。傳統拉絲試驗操作簡單，在臨床上初步篩查高毒力菌株還是具有一定的參考意義。從分子生物學角度檢測hvKP相關的毒力基因、莢膜血清型、ST分型，亦或是利用動物感染模型驗證高毒力，均可增加hvKP鑒定的準確性。新興的MALDI-TOF MS技術、宏基因組測序技術，與傳統的基因分析技術聯合應用，有望為臨床提供快速的病原學證據，從而及時有效治療hvKP引起的感染。