NAFLD 合并II 型糖尿病患者腸道菌群分析研究

田楠楠

（河南省焦作衛生醫藥學校附屬醫院檢驗科，焦作 450001）

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一種發病率最高的慢性肝病之一，指除了酒精和其他確切致肝損傷因素外，以肝細胞脂肪過度沉積為主要表現的全身代謝綜合征[1]。糖尿病由一系列危險因素（如遺傳、超重、年齡及不良生活習慣等）引起的疾病，其中85%～95%為II 型糖尿病（T2DM）[2]。NAFLD 與T2DM 關系密切，常伴隨脂代謝紊亂和動脈粥樣硬化等疾病，T2DM 患者中NAFLD 的患病率為50%～80%，而NAFLD 患者中糖尿病的發病風險升高2～5 倍，NAFLD 合并T2DM 者的嚴重肝病事件發生率會明顯上升[3-4]。腸道菌群種類可達1000 多種，細菌總數有100 萬億，腸道微生態系統是人體最大最復雜的微生態系統，對維持機體穩態有重要作用。腸道與肝臟來源于同一胚層，二者在結構和功能上有關系密切，因此腸道微生態的失衡與NAFLD 也有密切關系。腸道菌群紊亂會打破宿主能量吸收和儲存的平衡，能量吸收速率增強，常伴隨體重的顯著增加，進一步加重代謝紊亂程度，同時能加重胰島素抵抗和肝臟內的炎癥反應，使肝臟毒素的產生增多，最終導致肝纖維化、肝硬化甚至發生肝癌[5]。本研究通過研究NAFLD 合并T2DM 患者和健康人群的腸道菌群情況，以期為該病的治療提供一定的思路，具體如下。

1 研究對象

1.1 基本信息 以2017 年1 月至2019 年12 月就診于我院的NAFLD 合并T2DM 患者為研究組，共86 例，其中男性50 例，女性36 例，平均年齡（41.6±15.3）歲；另以80 例健康人群為對照組，男性50例，女性36 例，平均年齡（42.7±14.8）歲。兩組基本信息如性別構成比、年齡等經分析無統計學意義(P＞0.05)，具有可比性。患者及家屬均充分了解研究內容并簽署知情同意書，本研究已獲得醫院倫理委員會的準許。

1.2 納入與排除標準 納入標準：（1）符合NAFLD和II 型糖尿病的診斷標準[6-7]；（2）年齡18～75 歲者；（3）BMI≥18.5；（4）無其它系統重大疾病。排除標準：（1）合并酒精性肝病、慢性乙肝、慢性丙肝等肝病者；（2）近期服用過抗生素、微生態制劑以及胃腸動力藥者；（3）有炎癥性腸病、庫欣綜合征、甲狀腺功能減退癥等患者；（4）已進展至肝硬化階段者。

2 研究方法

2.1 標本采集 所有研究對象于入院24 h 內，采集糞便樣品，使用糞便采集管收集3～5 g 標本，存于-80 ℃冰箱。

2.2 檢測方法 采用QIAamp ?DNA Stool Mini 試劑盒進行腸道菌群的監測，嚴格按說明書進行操作。將樣本與ASL 液混合均勻，進行細菌裂解、孵育離心后清除糞便抑制劑，以醇沉法提取DNA 以去除多糖、蛋白質。以緩沖液溶解后過柱子進行極性洗脫，回收洗脫液得糞便細菌總DNA，以illumina hiseq 平臺檢測腸道菌群情況，對樣本基因片段進行測序，讀取核苷酸種類，通過每輪所收集的熒光信號獲得模板DNA 片段的序列。

2.3 觀察指標 采用Usearch 10.0 在97%相似度下進行聚類獲得操作分類單元（Operationa l taxonomic units，OTU），根據Silva 數據庫對OTU 進行分類學注釋，采用Qiime 1.9.0 進行alpha 多樣性分析，以了解樣本微生物多樣性程度，利用Kruskal?Wallis 計算豐度差異情況等。

2.4 數據處理 以SPSS 19.0 對數據進行分析，計量資料以()表示，使用t 檢驗，P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果分析

3.1 兩組OTU 分布比較 在97%相似度的水平下，本研究對研究組和對照組的樣本測序數據進行OTU 聚類，比較兩組中共有和獨有的OTU 數，結果見圖1 所示。兩組共得到OTU 數為713 個，其中有480 個為研究組和對照組所共有的，研究組獨有OTU 數為81 個，對照組獨有OTU 數為152個，對照組OTU 多于研究組。

3.2 樣品Alpha 多樣性 研究組Shannon、Simpsin、ACE、Chaol 指數與對照組相比無顯著差異（P＞0.05），Observe 指數顯著低于對照組（P＜0.05）。表明研究組腸道菌群豐富度低于對照組。

表1 兩組a 多樣性指數比較

3.3 兩組腸道菌群豐度差異 在門水平上，與對照組相比，研究組厚壁菌門、放線菌門和柔壁菌門豐度降低，抑桿菌門豐度顯著升高，差異有有統計學意義（P＜0.05）。在屬水平上，研究組Subdoligranulum、Enterobacter、Coprococcus、Klebsiella、Bifidobacterium、Lactobacillus 屬菌顯著減少，而Bacteroides、Flavonifractor 菌屬顯著增加（P＜0.05）。

3.4 LEfSe 分析根據 根據微生物分類數據，進行LEfSe 分析，顯示研究組中以擬桿菌、產堿菌、幽門螺桿菌等致病菌為優勢菌；對照組中以厚壁菌門、雙歧桿菌以及乳酸桿菌等有益菌為優勢菌。

4 討論與結論

NAFLD 是指沒有飲酒嗜好的人肝內脂肪蓄積甚至發生脂肪變性和炎性改變，患病率呈逐年升高趨勢，其發病機制主要是由游離脂肪酸增多所導致的胰島素抵抗和氧化應激，常合并糖尿病，肥胖、高血脂、高血壓等疾病，有研究表明：NAFLD 可能為一種胰島素抵抗在肝臟的表現[8-9]。T2DM 與NAFLD 緊密聯系，互相影響。腸道菌群的紊亂可能與NAFLD 的進展有關。腸道菌群的改變能通過促進胰島素抵抗、生成內源性乙醇、產生內毒素引起體內的炎癥反應等途徑，推動NAFLD 及其代謝綜合征的進展[10]。各種原因引起的腸道菌群的細菌移位，能產生LPS、肽聚糖等代謝產物，刺激炎癥因子的釋放，激活多種炎癥通路，進而引起脂質膽堿代謝、內源性乙醇的生成等一系列病理變化，使IR和脂質產生病理性累積，最終導致NAFLD 及T2DM 等代謝綜合癥[11]。

表2 兩組在門、屬水平上腸道菌群豐度差異比較

在97%相似度的水平下，本研究對研究組和對照組的樣本測序數據進行OTU 聚類，結果顯示兩組共得到OTU 數為713 個，其中有480 個為研究組和對照組所共有的，研究組獨有OTU 數為81個，對照組獨有OTU 數為152 個，對照組OTU 多于研究組。表現為NAFLD 合并T2DM 患者的腸道菌群多樣性總體上較健康人群低。對三組α 多樣性指數進行分析，顯示Observe 指數顯著低于對照組，表明研究組腸道菌群豐富度低于對照組，而兩組間Shannon、Simpsin、ACE、Chaol 指數無統計學差異。可能與研究中納入的樣本量較小有關。

腸道菌群與肝臟在功能上也有密切聯系，與機體的營養、代謝和免疫等均有緊密相關，其中厚壁菌門和擬桿菌門是主要的細菌，占總微生物群落的99%左右[12]。在門水平上，與對照組相比，研究組厚壁菌門、放線菌門和柔壁菌門豐度降低，抑桿菌門豐度顯著升高，差異有統計學意義。在屬水平上，研究組Subdoligranulum、Enterobacter、Coprococcus、Klebsiella、Bifidobacterium、Lactobacillus 屬菌顯著減少，而Bacteroides、Flavonifractor 菌屬顯著增加（P＜0.05），顯示Bacteroides、Flavonifractor 菌屬可能為NAFLD 及T2DM 的危險因素。根據LEfSe 分析結果顯示研究組中以擬桿菌、產堿菌、幽門螺桿菌等致病菌為優勢菌；對照組中以厚壁菌門、雙歧桿菌以及乳酸桿菌等有益菌為優勢菌。擬桿菌科中的多形擬桿菌能分裂糖苷鍵，可降解無法被人體吸收的植物多糖，增加腸道10%～15%的能量吸收，進而增加宿主脂肪含量[13]。擬桿菌在死亡過程中會產生大量脂多糖（LPS），LPS 局部蓄積于腸道引起炎癥，通過門靜脈進入肝臟，被存在于肝巨噬細胞上Toll 樣受體4（TLR4）識別后，活化LPS/TLR4 信號通路引發肝臟炎癥和胰島素抵抗，參與NAFLD 發病[14]。腸道幽門螺桿菌能引起轉化生長因子-β1 的表達增加，并激活肝星狀細胞促炎信號通路，促進細胞外基質的形成同時抑制其降解，進而誘導肝細胞凋亡等機制在肝炎進展中起促進作用[15]。

綜上所述，NAFLD 合并T2DM 患者腸道菌群豐富度下降，與健康者有較大差異。