膿毒癥大鼠腸黏膜Slit2/Robo4蛋白表達及其與血管生成的關系

陳盈泰 吳昊 張森 李文放 王慮

膿毒癥是臨床急危重癥患者的常見病死原因[1]。研究發現，在膿毒癥的病理生理進程中，胃腸道發揮著重要作用。在嚴重感染情況下，致病因素造成腸黏膜屏障損害，可以使腸道微生物和內毒素遷移到腸系膜淋巴結、血液以及某些腸外臟器，發生腸源性膿毒癥[2]。腸黏膜屏障結構和功能的維持主要依賴腸黏膜微循環及微血管內皮細胞結構和功能。血管結構的維持有賴于血管內皮細胞，起到分隔組織和血液的作用，防止血液里的蛋白和細胞透入血管壁[3]。血管內皮細胞的存活和增殖有賴于血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），是開啟和形成新生血管過程中的重要分子。神經遷移因子Slit 及其受體Robo 蛋白屬于分泌蛋白家族。研究發現，亞型Slit2 蛋白有促進人臍靜脈內皮細胞遷移及體外血管生成的作用，Robo4 具有血管表達特異性，在血管新生活躍區域附近的血管內皮細胞上高表達，因此Slit2/Robo4 信號在血管新生及內皮細胞遷移過程中具有重要作用。研究發現，slit2/Robo4可以抑制血管內皮細胞遷移、成管，增加內皮細胞完整性，增強血管穩定性，減少血管通透性，從而使腸黏膜屏障得到保護[4]。本研究通過Slit2/Robo4 蛋白在膿毒癥模型大鼠腸黏膜血管內皮細胞的表達及其與血管內皮生長因子的關系，探討其維護腸黏膜微血管內皮細胞功能和保護腸黏膜屏障的機制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

清潔級成年健康雄性SD 大鼠16 只，體質量230～250 g，由海軍軍醫大學實驗動物中心提供（動物許可證號：Sc2k 滬2020-016）。隨機分為假手術組（n=8）、膿毒癥組（n=8），膿毒癥組模型制備采用盲腸末端結扎穿孔（cecal ligation and puncture，CLP）法。制模前大鼠先予12 h 的禁食，不禁水。腹腔麻醉使用1%戊巴比妥溶液（30 mg/kg）。大鼠予放置仰臥位，在腹部手術部位備皮。等麻醉藥物起效后，取下腹部正中切口，切開約1 cm，逐層分離直至進入腹腔，整個手術過程嚴格遵循無菌原則。找到并確認盲腸后，細致游離盲腸腸系膜，使用鑷子將腸內容物推向盲腸遠端，使用手術絲線游離盲腸總長度的50%左右，隨后予以結扎。在已結扎的盲腸的游離端用針頭對穿一次，同時擠出少量腸內容物。假手術組不進行盲腸結腸及穿孔操作，余操作方法同膿毒癥組。24 h 后處死大鼠，用4%多聚甲醛固定實驗用回腸末端組織約5 cm。

1.2 觀察指標及檢測方法

1.2.1 Slit2/Robo4、VEGF mRNA表達量檢測 采用聚合酶聯反應（polymerase chain reaction，PCR）的方法，首先進行DEPC水（DEPC處理水，基爾頓生物R1600）配置：在1 000 mL的ddH2O中加入1 mL DEPC原液，磁力攪拌器攪拌過夜。高壓滅菌備用。隨后進行總RNA提取，將大鼠腸組織放入1 mL的Trizol勻漿管中勻漿（電動勻漿機FLUKO PRO200）20 s，隨后溫育5 min，離心10 min，靜止后吸取上清液，在上清液中加入600 μL異丙醇（國藥集團，貨號：80109218）混合均勻，室溫靜置15 min，4℃，12 000 r/min，離心15 min，棄上清，加入1 mL 75%無水乙醇（國藥集團，貨號：100092680）漂洗沉淀、靜止和離心，重復一次后，棄去上清液后添加DEPC水40 μL，放入冰箱（-80℃）備用。接著進行第一條cDNA的合成，先去除總RNA中的DNA，隨后進行逆轉錄（試劑盒購自Fermentas，貨號：#K1622）。最后將制備好的cDNA進行PCR擴增（試劑盒購自Thermo，貨號：#K0223）。以Primer F 5' CTTGTGCTGATGGGTTTG3'；Primer R 5'AGTTCGCCTGTGTATTCC 3'作為上下引物擴增Slit2 mRNA，擴增大小為142 bps；以Primer F 5' GAGGTCGGGAACTTACTGTG3'；Primer R 5' GGAAGGAGCCATCAGAAGAG 3'為上下引物擴增Robo4 mRNA，擴增大小為148 bps；以Primer F 5' AGACCCTGGTGGACATCTTC3'；Primer R 5' TGTGCTGGCTTTGGTGAG 3'為上下引物擴增VEGF mRNA，擴增大小為183 bps。以Primer F 5' GGAGTCTACTGGCGTCTTCAC3'；Primer R 5' ATGAGCCCTTCCACGATGC 3'為上下引物擴增GAPDH，擴增大小為237 bps。數據采用儀器自帶軟件分析：ABI Prism 7300 SDS Software。

1.2.2 Slit2/Robo4 蛋白的表達 采用Western 印跡法，首先將大鼠腸組織放入裂解液中進行裂解，隨后勻漿離心（4℃，1 200 r/min，15 min），靜止后取上清，蛋白質定量后保存于冰箱（-80℃）。細胞樣品用PBS 液洗滌兩次，離心取上清，蛋白質定量后備用。其次進行蛋白定量（BCA 蛋白定量試劑盒Thermo，PICPI23223），吸光度在波長562 nm 處測定，采用橫坐標為吸光值，縱坐標為蛋白濃度（μg/μL）繪制標準曲線，然后測定樣品吸光值，計算出樣品實際濃度。隨后選取不同的凝膠濃度制備PAGE 膠。緊接著進行上樣及電泳、半干轉膜、膜上蛋白檢測。隨后進行膜的封閉，根據說明書Slit（abcam ab134166）1∶1 000、robot（Santa Cruz sc-166872）1∶500、GAPDH（CST#5174）1∶1 000稀釋抗體，制備一抗。隨后稀釋HRP（羊抗小鼠HRP 標記二抗：中山金橋ZB-2305；羊抗兔HRP 標記二抗：中山金橋ZB-2301）標記的二抗，與膜同時37℃孵育1 h。用TBST 洗滌3 次，完成抗體孵育。最后進行ECL 化學發光顯色（發光液：Millipore WBKLS0100），放入成像系統（Tanon Tanon-5200）進行掃描。

1.3 統計學方法

使用SPSS 20.0 軟件進行數據處理，計量資料采用（）表示，組間比較采用t檢驗，Slit2/Robo4 蛋白表達與VEGF 表達的相關性采用Pearson 秩相關檢驗，以α=0.05 作為檢驗水準，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Slit2 的表達量

通過PCR 及Western 實驗發現Slit2 蛋白在膿毒癥組及假手術組均有表達，膿毒癥組蛋白表達量明顯低于假手術組，差異有統計學意義[CT值：（25.51±0.33）vs.（2 4.4 3±0.2 5），t=-7.679，P＜0.001；mRNA：（0.020±0.004）vs.（0.040±0.008），t=6.168，P＜0.001；灰度值：（10 601.15±1 438.07）vs.（16 482.38±1 671.07），t=-5.830，P＜0.001]，見圖1～4。

2.2 Robo4 的表達量

PCR及Western實驗結果發現Robo4蛋白在膿毒癥組及假手術組均有表達，在膿毒癥組蛋白表達量明顯低于假手術組，差異有統計學意義[CT值：（25.80±0.62）vs.（2 4.5 3±0.2 9），t=-4.737，P＜0.001；mRNA：（0.016±0.004）vs.（0.037±0.006），t=8.330，P＜0.001；灰度值：（12 206.99±129.52）vs.（20 089.75±1 535.14），t=8.462，P＜0.001]，見圖1～4。

圖1 slit2、robo4 蛋白Western 表達

2.3 VEGF 的表達量

同樣采用PCR 的方法，實驗結果發現VEGF 蛋白在膿毒癥組及假手術組均有表達，在膿毒癥組蛋白表達量明顯高于假手術組，差異有統計學意義[CT 值：（23.81±0.35）vs.（25.34±0.31），t=13.217，P＜0.001；mRNA：（0.064±0.018）vs.（0.021±0.003），t=-6.338，P＜0.001），見圖3～4。

圖2 slit2、robo4 蛋白灰度表達

圖3 slit2、robo4、VEGF 蛋白CT 值

圖4 slit2、robo4、VEGF 蛋白mRNA

2.4 Slit2/Robo4 與VEGF 蛋白表達量的相關性

在PCR 實驗中Slit2 蛋白表達量與VEGF 蛋白表達量呈負相關（CT 值：r=-0.744，P=0.001；mRNA 值：r=-0.688，P=0.003），Robo4 蛋白表達量與VEGF 蛋白表達量呈負相關（CT 值：r=-0.674，P=0.004；mRNA 值：r=-0.836，P＜0.001），見表1。Slit2 蛋白表達量與Robo4 蛋白表達量呈正相關（CT 值：r=0.814，P＜0.001；mRNA 值：r=0.805，P＜0.001），見表2。

表1 Slit2/Robo4 與VEGF 蛋白表達量之間的相關性

表2 Slit2/Robo4 蛋白表達量之間的相關性

3 討論

膿毒癥的病理、生理學機制復雜，涉及炎癥反應、免疫調控、凝血障礙和神經/內分泌系統等[5]。腸道作為全身重要的消化吸收器官，具有豐富的微生物群體，這也是機體從感染發展到膿毒癥重要因素。腸道微血管內皮結構和功能的破壞是腸源性膿毒癥發生機制之一[6]。目前研究發現Slit2/Robo4 具有抑制血管內皮細胞遷移、成管，增加內皮細胞完整性，增強血管穩定性，降低血管通透性的作用[7]。研究發現Slit2/Robo4 在膿毒癥模型大鼠腸黏膜微血管內皮細胞中存在表達，提示Slit2/Robo4蛋白可以保護膿毒癥模型大鼠腸黏膜屏障，避免腸源性膿毒癥的發生。

目前在膿毒癥治療新方法的研究中，London 等[8]研究發現Slit 蛋白對滲漏的血管具有超級黏膠樣作用，從而加強機體承受其自身免疫攻擊的能力。同樣在袁熙等[9]研究中提示Slit 蛋白與其受體Robo 結合可以穩定血管系統，避免過度的炎癥反應對正常組織的損傷。Weng 等[10]在輸血相關的急性肺損傷模型研究中發現Slit2/Robo4 蛋白在肺微血管內皮細胞上有表達，且表達量明顯降低。本研究發現，Slit2/Robo4 蛋白在膿毒癥組及假手術組腸道血管內皮細胞上均有表達。結果顯示Slit2/Robo4 蛋白表達量呈正相關，并且在膿毒癥組表達量明顯下降（P＜0.05），提示該蛋白參與了腸源性膿毒癥的病理、生理過程，其減少原因可能存在消耗性減少。Qin 等[11]在內毒素導致的膿毒癥模型研究中發現的現象與本研究結果相似，證實了本研究的結果和推測。

本研究結果顯示，VEGF 在兩組實驗大鼠中均有表達，且在膿毒癥組表達量明顯增加（P＜0.05）。因為VEGF 可促進血管內皮細胞的遷移和增殖，保持內皮細胞的活性，提高血管通透性，在新生血管形成和開啟過程中有著重要作用。當膿毒癥發生時，血管內皮功能遭受破壞，血管通透性增加，從而發生血管滲漏。因此在膿毒癥模型大鼠腸黏膜血管組織中VEGF 蛋白表達量明顯增加，促進血管內皮細胞增殖和遷移，進一步加重內皮損傷，增加血管的通透性，這與本研究結果相吻合。

本研究結果還顯示，Slit2/Robo4 蛋白表達量與VEGF 蛋白表達量呈負相關（P＜0.05）。相關研究發現Slit2/Robo4 在體外能抑制VGEF、FGFs 誘導的內皮細胞遷移，同時在體內可以抑制血管的新生和滲透[12]，有研究表明[13]，增生型糖尿病視網膜病變患者的血管膜中VEGF 和Robo4 共表達，Robo4 對于血管的生成起促進作用。本研究中，Robo4 蛋白表達量下降，VEGF 蛋白表達量增加，兩者之間呈負相關。同樣，目前有學者認為Slit2/Robo4 信號能對抗VEGF/VEGF 受體信號，血管新生及內皮細胞遷移，減少血管通透性，保持血管內平衡。因此從Slit2/Robo4 蛋白表達量呈正相關、與VEGF 蛋白表達量呈負相關這一結果，可以推斷在膿毒癥模型大鼠腸黏膜上存在Slit2/Robo4 蛋白抑制VEGF 所產生的血管新生、內皮遷移和血管通透性增加的作用，從而保護腸黏膜屏障功能，防止腸源性膿毒癥的發生。目前已有研究證實Slit2 能降低VEGF 誘導的血管通透性上調[14]，有研究發現Slit2 蛋白依賴Robo4 發揮功能，且Robo4 通過一種非導向機制，抑制促血管生成因子誘導的新生血管芽及內皮通透性增加來維持成熟血管網的屏障功能[15]，從而佐證本研究的推斷。

在下一步的研究中，擬構建膿毒癥Slit2 基因敲除動物模型和人重組Slit2 組動物模型，進一步探討Slit2/Robo4 蛋白能否通過抑制血管內皮生長因子，減少因炎癥細胞因子所致的血管滲漏，保持血管系統的穩定性。同時，擬在膿毒癥動物模型上檢測多個時間點內Slit2/Robo4 蛋白和VEGF 蛋白的表達水平，以動態觀察其變化趨勢，探索其在膿毒癥中的表達規律。

綜上所述，通過在膿毒癥模型大鼠中檢測腸黏膜血管組織中Slit2/Robo4 與VEGF 的蛋白表達量，發現在膿毒癥模型大鼠的腸黏膜血管組織中Slit2、Robo4 蛋白表達量明顯下降，VEGF 蛋白表達量明顯增加。同時Slit2/Robo4 蛋白表達量呈正相關，VEGF 蛋白表達量與Slit2/Robo4 蛋白表達量呈負相關。膿毒癥模型大鼠腸黏膜血管中Slit2/Robo4 與VEGF 蛋白表達量的變化，與腸黏膜屏障系統的穩定性密切相關，這為探討腸黏膜屏障保護機制提供了研究方向。