厄貝沙坦片含量測定中研缽吸附對含量檢測結果的影響

路瑤 歐永玉 李欽 劉小清 鄭悅 賈毓寧 豐杰

高血壓是一種常見和多發的慢性心血管疾病，主要表現為體循環動脈血壓升高，可分為原發性和繼發性高血壓，長期血壓水平過高會出現靶向器官嚴重受損，威脅患者生命安全[1-2]。近年來，隨著醫學水平提高，原發性高血壓病死率明顯降低，但仍有部分患者靶向器官受損，發生不良心血管事件[3]。原發性高血壓治療過程中，最為關鍵的是藥物的選擇和使用，厄貝沙坦（Irbesartan）是一種長效高選擇性血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ）受體拮抗劑，能特異性地拮抗血管緊張素Ⅱ受體（AT1），屬于二苯咪唑類化合物，口服后能迅速吸收，生物利用度為60%～80%，消除半衰期為11～15 h，是治療高血壓的一線藥物之一，近年來在臨床上廣泛應用[4-7]。厄貝沙坦片為白色或類白色薄膜衣片，含有薄膜衣時，薄膜衣碎片通常很難研細，特別是腸溶衣（丙烯酸7 樹脂），延展性較強，不易溶解和研磨，影響粉末的均勻性，從而影響厄貝沙坦含量測定結果的準確性。去掉包衣或薄膜衣會損失部分主藥，導致含量下降。故應結合實際檢測需要并綜合考慮操作各方面因素，確定采用何種操作來檢驗厄貝沙坦的含量，達到不去除薄膜衣又不影響測定結果[8-9]。本文就研磨時間、有無預研磨操作及研缽材質進行研究，考察厄貝沙坦片中厄貝沙坦的含量情況，摸索確定最佳的厄貝沙坦含量測定方法。

1 儀器與試藥

儀器：Agilent1260 型高效液相色譜儀、XPE105 型電子天平、KH-1000E 型超聲儀。

試藥：乙腈、甲醇使用色譜級，磷酸、三乙胺使用分析級，純化水自制，厄貝沙坦對照品購自中國食品藥品檢定研究院（批號：100608-201804），科蘇（厄貝沙坦片）（一致性評價）（0.075 g）由揚子江藥業集團北京海燕藥業有限公司提供，移液管、容量瓶等準確度等級為A 級。

2 相關材料

2.1 色譜條件

色譜柱：APLLO-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm），流動相：磷酸溶液：乙腈（62∶38），檢測波長：245 nm，柱溫：30℃，流速：1.0mL/min，進樣量：10 μL。

2.2 系統適用性溶液

分別取105℃干燥至恒重的厄貝沙坦對照品與雜質I對照品各適量，加甲醇溶解并稀釋制成每1 毫升中各約含0.1 mg 的混合溶液，搖勻即得，作為系統適用性溶液。

2.3 對照品溶液

精密稱取105℃干燥至恒重厄貝沙坦對照品約40 mg，置200 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定量稀釋制成每1 毫升中含0.2 mg 的溶液，搖勻即得，作為對照品溶液。

2.4 待測樣品溶液

取厄貝沙坦片20 片，精密稱定計算平均片重，將厄貝沙坦片研磨，取研磨后的樣品細粉（約相當于厄貝沙坦20 mg），置100 mL 量瓶中，加甲醇適量，超聲10 min 使厄貝沙坦溶解，并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液作為待測樣品溶液。

3 實驗方法和結果

按照Chp2015 版四部藥品質量標準分析方法驗證指導原則開展實驗。

3.1 系統適用性試驗

在高效液相色譜法中，色譜系統的適用性試驗通常包括理論板數、分離度、靈敏度、拖尾因子和重復性等五個關鍵參數[10-12]。其中理論塔板數是柱效的具體體現，對實驗結果產生直接影響。故用規定的系統適用性試驗，取10 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖，出峰順序依次為雜質I 峰與厄貝沙坦峰，雜質I 峰與厄貝沙坦峰的分離度應大于2.0，理論板數按厄貝沙坦峰計算不低于2 000。以雜質I 峰與厄貝沙坦峰的分離度及厄貝沙坦峰的理論塔板數為指標，考察系統的適用性[13-14]。

按要求對色譜系統進行適用性試驗，出峰順序、分離度、理論板數均符合國家藥品監督管理局YBH07772019 含量測定項下要求。

3.2 專屬性試驗

取空白溶液、對照品溶液和待測樣品溶液，取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，樣品溶液主峰的保留時間與對照品溶液主峰保留時間一致，空白溶液在主峰位置應無干擾色譜峰。

樣品溶液與對照品溶液兩者主峰保留時間一致，空白溶液在主峰位置均無干擾色譜峰。

3.3 線性

精密稱取105℃干燥至恒重厄貝沙坦對照品約40 mg，置200 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定量稀釋制成每1 毫升中含0.2 mg 的溶液，分別量取1.0、4.0、5.0、6.0、10.0 mL，置10 mL 的容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度制成各濃度線性溶液。取10 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸分析，繪制標準曲線。在（0.04～0.40）mg/mL 濃度范圍內，主峰濃度與峰面積的線性關系良好。

3.4 檢測限和定量限試驗

檢測限：取105℃干燥至恒重厄貝沙坦對照品加甲醇溶解并不斷稀釋成主峰與噪音峰信號的強度比約為3 時，得到被檢測出的最低濃度即為檢測限濃度[15-16]，取檢測限溶液分別進樣3 針注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

連續進樣3 針主峰峰面積及保留時間的重復性相對標準偏差均不大于2.0%，檢測限的濃度為0.038 μg/mL。

定量限：取105℃干燥至恒重厄貝沙坦對照品加甲醇溶解并不斷稀釋成主峰與噪音峰信號的強度比約為10 時，得到定量檢測出的濃度即為定量限濃度[15-16]，取定量限濃度分別進樣6 針注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

連續進樣6 針主峰峰面積及保留時間的重復性相對標準偏差均不大于2.0%，檢測限的濃度為0.13 μg/mL。

3.5 精密度試驗

取厄貝沙坦片20 片，精密稱定計算平均片重，將厄貝沙坦片研磨，取研磨后的樣品細粉（約相當于厄貝沙坦20 mg），置100 mL 量瓶中，加甲醇適量，超聲10 min 使厄貝沙坦溶解，并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液制成6 份，由一個檢測人員分別取10 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

所得6 份樣品溶液中，主峰峰面積及保留時間的重復性相對標準偏差均不大于2.0%，說明該方法重復性及儀器精密度良好。

3.6 溶液穩定性試驗

精密稱取105℃干燥至恒重厄貝沙坦對照品約40 mg，置200 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定量稀釋制成每1 中含0.2 mg 的溶液，分別在室溫下放置0、4、8、12、18、24、36、42、48 h 后取10 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

取厄貝沙坦片20 片，精密稱定計算平均片重，將厄貝沙坦片研磨，取研磨后的樣品細粉（約相當于厄貝沙坦20 mg），置100 mL 量瓶中，加甲醇適量，超聲10 min使厄貝沙坦溶解，并用甲醇稀釋至刻度搖勻即得，分別在室溫下放置0、4、8、12、18、24、36、42、48 h 后取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

對照品溶液在室溫放置0、4、8、12、18、24、36、42、48 h 后，各個時間點主峰峰面積與0 h 的峰面積比值均在98.0%～102.0%范圍內。

樣品溶液中，在室溫放置0、4、8、12、18、24、36、42、48 h 后，各個時間點主峰峰面積和0 h 的峰面積RSD%小于2.0%。

表明對照品溶液和樣品溶液在室溫條件下放置48 h 內穩定。

3.7 加樣回收試驗

稱取不含主成分的陰性空白制劑約20 mg，分別加入主成分16、20、24 mg 各3 份，分別置100 mL 容量瓶中，并用甲醇稀釋至刻度搖勻即得，制得濃度分別為80%、100%和120%的樣品溶液，共9 份。取空白溶劑、對照品溶液及不同濃度的回收率樣品溶液各10 μL，按2.1 項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖。

按外標法計算加樣回收率，結果見表1。平均回收率（n=9）為98.37%。

表1 厄貝沙坦加樣回收試驗結果（n=9）

4 含量測定

精密量取2.2 項下系統適用性溶液、2.3 項下對照品溶液和2.4 項下樣品溶液各10 μL，注入液相色譜儀。進行不同研磨時間，有無預研磨操作，不同材質研缽對厄貝沙坦含量測定結果的影響試驗。

實驗1：取3 批厄貝沙坦片（批次分別是20071651、20090951、20101051）各20 片，每批樣品在陶瓷研缽中分別研磨2、3、5 min，按照2.4.樣品溶液的制備方法進行制備，測定厄貝沙坦片中厄貝沙坦的含量。從表2 及圖1 中可以看出，研磨時間由2 min 到3 min，厄貝沙坦片的含量依次降低，說明研磨時間的延長，導致陶瓷研缽吸附繼而會導致厄貝沙坦含量結果的降低。3 min 到5 min 結果基本一致，趨于平緩，說明研磨吸附飽和后，不會再影響厄貝沙坦片的含量測定結果。

圖1 不同研磨時間對厄貝沙坦片含量測定結果的影響

表2 不同研磨時間對厄貝沙坦片含量測定結果的影響（%）

實驗2：針對陶瓷研缽吸附問題，采用預研磨和不預研磨開展實驗，按下述方法進行測定。（1）預研磨操作：取批號為21032251 的厄貝沙坦片10 片，在陶瓷研缽中研磨5 min，棄去內容物，另取該批厄貝沙坦片20 片，在上述陶瓷研缽中研磨3 min，混勻后按照2.4 樣品溶液的制備方法進行制備，測定厄貝沙坦片中厄貝沙坦的含量；（2）不預研磨操作：取批號為21032251 的厄貝沙坦片20 片，在陶瓷研缽中研磨3 min，混勻后按照2.4 樣品溶液的制備方法進行制備，測定厄貝沙坦片中厄貝沙坦的含量。從表3可以看出，陶瓷研缽預研磨的厄貝沙坦片含量結果要高于未經過預研磨的陶瓷研缽測定出的含量。這也驗證了實驗1中的結論，陶瓷研缽吸附會影響含量測定結果。

表3 預研磨與不預研磨操作對厄貝沙坦片中厄貝沙坦含量的影響對比（%）

實驗3：不同研缽材質、研磨操作對厄貝沙坦片含量測定結果的影響。（1）取批號為21032251 的厄貝沙坦片10片，在陶瓷研缽中研磨5 min，棄去內容物，另取厄貝沙坦片20 片，在陶瓷研缽中研磨3 min，混勻后稱取三份平行樣品，按照2.4 樣品溶液的制備方法進行制備，測定厄貝沙坦片中厄貝沙坦的含量。（2）取批號為21032251 的厄貝沙坦片20 片，在瑪瑙研缽研磨3 min，混勻后稱取三份平行樣品，按照2.4 樣品溶液的制備方法進行制備，測定厄貝沙坦片中厄貝沙坦的含量。從表4 數據來看，更換不同材質研缽，瑪瑙研缽研磨與使用陶瓷研缽預研磨進行測定，對厄貝沙坦片含量測定結果幾乎相差不大，更加證明研缽材質不同，對厄貝沙坦吸附影響不同，導致厄貝沙坦含量測定結果不同。

表4 同一批樣品采用陶瓷研缽預研磨與瑪瑙研缽不預研磨的測定結果（%）

5 討論

在厄貝沙坦片含量測定過程中，決定研磨效果的主要因素有：被研磨物的料性，研磨的材質，研磨壓力及研磨的速度等[17]。本文針對不同的研磨時間，考察陶瓷研缽對厄貝沙坦的吸附影響。針對吸附問題，對比有無預研磨操作對厄貝沙坦含量測定結果的影響。此外，對比陶瓷、瑪瑙不同材質的研缽對厄貝沙坦含量測定結果的影響，找出影響厄貝沙坦含量測定結果的影響因素。綜上所述，選擇合適的研磨時間，及研磨操作方式、研缽材質，能夠較真實的反映出厄貝沙坦片中厄貝沙坦的實際含量。從實驗結果來看，為減少陶瓷內表面粗糙導致的吸附，可使用瑪瑙研缽直接研磨樣品進行厄貝沙坦的含量測定。若無瑪瑙研缽，可使用陶瓷研缽進行樣品預研磨，使研缽吸附飽和樣品后，再進行厄貝沙坦的含量測定。