改良的熒光標記菊粉清除率檢測法在糖尿病小鼠腎損傷評估中的應用

劉 琳，姜世敏，張浩軍，李 鴻，楊 悅，卓 莉，李文歌

（1.中日友好醫院腎病科，北京 100029；2.中日友好醫院臨床醫學研究所，北京 100029）

菊粉是一種完全經腎小球自由濾過而不被腎小管重吸收，也不被腎小管分泌的惰性物質，是用于腎小球濾過率（glomerular filtration rate，GFR）檢測的理想物質之一。然而由于小鼠血、尿標本有限、收集困難，傳統方法菊粉清除率操作復雜，實驗條件要求高[1，2]。近年來，Zhonghua Qi 等人報道了通過檢測異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）標記的菊粉（FITC-菊粉）熒光衰減速率反映GFR 的方法[5]，但其應用并未得到廣泛開展，尤其國內幾乎無人使用。本研究首先嘗試改進該方法，希望為小鼠GFR 測定提供準確性高同時可行性強的方法。此外，db/db是先天性2 型糖尿病小鼠，目前尚缺少關于其GFR 變化的長期觀察研究，因此本文在建立穩定方法后連續測定了db/db 小鼠在28 周齡內的GFR 變化，同時評估了其蛋白尿、腎臟病理等改變，為確證db/db小鼠作為糖尿病腎病腎小球高濾過狀態研究的動物模型提供有益的嘗試。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

FITC-菊粉（瑞典TDB 公司）、HEPES 緩沖液（pH 7.4）、一次性使用微量采血吸管（江蘇康健華醫療用品有限公司）、肝素包被的1.5ml EP 管（江蘇康健華醫療用品有限公司）

1.2 實驗動物

SPF 級6 周齡雄性db/db 小鼠10 只及同窩雄性對照db/m 小鼠5 只，購買于南京模式動物研究所，實驗動物質量合格證號：SCXK（蘇）2018-0008，飼養于中日友好醫院SPF 級動物房，適應性喂養2周后開始實驗。血糖數據為禁食8h后檢測的空腹血糖。

1.3 小鼠清醒狀態下GFR的檢測方法

0.9%生理鹽水配制濃度為2.5%的FITC-菊粉，振蕩器充分攪拌溶解后用0.22μm 濾器過濾，于4℃冰箱避光保存。檢測前小鼠自由活動、自由飲食飲水，檢測前10min 內將0.3ml 飲用水灌胃以避免檢驗過程中因攝入不足造成血容量減少而影響GFR。將上述配制好的FITC-菊粉以3.7μl/g體重的劑量對清醒小鼠進行內眥靜脈叢勻速彈丸式注射，并計時為0 點。分別在注射后1、2、3、4、5、7、10、15、35、55、75min 使用一次性微量采血吸管于尾靜脈采血5μl，裝入肝素包被的EP 管避光保存。以3000r/min 離心后取上清（血漿）2μl，每個標本使用HEPES 緩沖液（pH 7.4）稀釋至40μl（稀釋20 倍）置于96 孔板中，于熒光酶標儀上檢測熒光強度，激發波長485nm，吸收波長583nm。同時將配制的FITC-菊粉以1：200 稀釋為40μl置于96孔板，設置3 個復孔，與血漿標本同時檢測熒光強度后取平均值，計算1μl FITC-菊粉對應的熒光值。每個檢測標本最終均以40μl 體積平鋪于96孔板中進行檢測，以避免體積對熒光讀數的影響。

應用GRAPH Pad Prism 8.0 中的two-phase exponential decay 進行統計分析，通過公式GFR=I/（A/α+B/β）計算GFR。其中I 為所測試小鼠實際注射的FITC 菊粉所對應的熒光值，A 和B 是2 個衰減對應的y 軸截距，α 和β 是2 段曲線的衰減常數（在GRAPH Pad Prism 8.0 中稱為Kfast、Kslow）。因FITC-菊粉在180min 以后血藥濃度趨近于0，在“contrain”欄中將“plateau”設置為“constant equal to 0”。

1.4 非同日GFR重復性檢測

使用上述GFR 檢測方法，隨機選取4 只db/db小鼠和4 只db/m 小鼠在非同日進行GFR 檢測，作為該方法的重復性檢測。

1.5 生化檢驗

在20 周齡、28 周齡隨機選取db/db 小鼠5 只和db/m 小鼠5 只，使用代謝籠留取12h 尿液標本用于檢測尿糖、尿微量白蛋白/肌酐。

1.6 小鼠腎組織病理檢查

處死20 周齡、28 周齡db/db 小鼠和db/m 小鼠各5 只，腎臟標本固定于4%福爾馬林后石蠟包埋，2μm切片后行PAS染色，光鏡下觀察。腎小球直徑：每只小鼠的PAS 染色切片在光鏡下隨機選取10 個帶血管極和（或）尿極的腎小球，測量經尿極和（或）血管極的直徑記為腎小球直徑，最后計算平均直徑[6]。

1.7 統計學方法

同一標本2 次結果的對比采用配對t檢驗。2組小鼠不同時間點體重、血糖及GFR 的比較采用兩因素重復測量方差分析，組間比較采用Mann-Whitney U 檢驗。連續變量采用均數±標準差表示。

2 結果

2.1 改良版小鼠FITC-菊粉清除率的計算過程解析及穩定性評估

在內眥靜脈叢注射FITC-菊粉之后1、2、3、4、5、7、10、15、35、55、75min 的小鼠血漿稀釋至40μl，實測熒光值減去空白對照平均熒光值（40μl HEPES 液所測得的熒光值，設置至少3 個復孔），再除以稀釋倍數，得到該時間點每微升血漿產生的熒光值，該值隨時間變化的曲線如圖1所示，符合兩室模型（two-phase exponential decay）。使用FITC-菊粉原液稀釋200倍，取40μl檢測熒光（設3 個復孔）用于計算每微升FITC-菊粉對應的熒光值，與注射的體積相乘得到小鼠注入的熒光總量I。以公式GFR=I/（A/α+B/β）計算GFR。

隨機選取4 只db/db 小鼠和4 只db/m 小鼠在非同日進行GFR 檢測，結果如圖2 所示，2 次檢測的GFR 一致性較好，雖均值略有差別，差異無統計學意義（配對t檢驗，P＞0.05）。因小鼠在清醒狀態下尾靜脈采血進行檢測，且時間點有固定要求，容易因不能配合等因素造成某個時間點采血失敗，因此本研究改良了文獻報道的方法，增加了時間點設計以保證獲得足夠的GFR 有效數據。為了驗證本方法的穩定性及可操作性，我們隨機選取10次小鼠的GFR 檢測數據，每次檢測的全部數據中任意去掉1個時間點，觀察缺少1個時間點對GFR 計算結果的影響。經GRAPH Pad Prism 8.0軟件驗證，缺少1 個時間點的數據所得的熒光衰減曲線符合兩室模型，能夠進行GFR 計算。如表1 所示，注射后1min 時間點的數據缺少使得GFR結果的偏差最大，平均達到31.0μl/min（范圍1～130μl/min），與原始GFR 的差異具有統計學意義（P＜0.05）。注射后2min 數據缺少計算GFR 結果的偏差為11μl/min（范圍3～24μl/min），但與原始GFR 相比差異仍具有統計學意義。從第3min 之后的數據缺少，對結果的影響差異均無統計學意義（P＞0.05），雖然15min 以后數據缺少所致GFR偏差達45～113μl/min，但主要發生在GFR＞1000μl/min 的檢測中，＜1000μl/min 檢測的差異仍然較小，無統計學意義（P＞0.05）。

圖2 同一小鼠非同日檢測GFR結果對比

表1 不同時間點缺少數據后的GFR數值（μl/min）

2.2 小鼠的血糖、體重及尿糖、尿蛋白變化

db/db 小鼠體型肥胖、毛色順滑，活動量顯著少于對照小鼠。圖3示，觀察組小鼠8周齡體重為42.5±4.9g，與正常對照組（22.9±1.5g）比較差異有統計學意義（P＜0.05），并且在8～28 周齡期間2 組差異均有統計學意義（P＜0.05），在28 周齡時體重達到最大值，為61.5±9.4g。db/db 小鼠在8 周時空腹血糖20.4±10.0mmol/L，與正常對照組（9.2±2.0mmol/L）比較差異有統計學意義（P＜0.05），血糖水平在28 周內基本保持穩定，2 組差異均有統計學意義（P＜0.05）。20 周齡和28 周齡db/db 小鼠的尿糖也顯著高于對照組小鼠，差異有統計學意義（P＜0.05）。20 周齡時db/db 小鼠的尿微量白蛋白/肌酐為38.07±27.73mg/mmol Cr，顯著高于對照小鼠0.04±0.01mg/mmol Cr（P=0.008）。28 周齡時db/db 小鼠的尿微量白蛋白/肌酐仍維持較高水平，為24.33±10.74mg/mmol Cr，顯著高于對照小鼠（P=0.029）。

圖3 db/db小鼠的體重和血糖變化

2.3 db/db小鼠GFR的變化

圖4 示，db/db 小鼠的GFR 均值在8～20 周齡期間高于正常對照組，其中第16周齡和20周齡分別為851.1±235.2μl/min 和796.0±338.7μl/min，與同期正常對照組（440.5±182.1μl/min 和299.6±74μl/min）相比，差異有統計學意義（P＜0.05），2 組間均值的差值達到410.6μl/min 和496.4μl/min。從第24 周齡開始，GFR 下降至與對照組接近，提示db/db小鼠的腎小球高濾過期持續至20周齡。

圖4 db/db小鼠的GFR動態變化

2.4 db/db小鼠腎臟病理改變

圖5（見封二）示，20 周齡的db/db 小鼠的腎臟病理表現為腎小球肥大，腎小球平均直徑為32.6±1.6μm，顯著高于對照小鼠（25.0±0.9μm），差異有統計學意義（P=0.08）。28周齡的db/db小鼠不僅存在腎小球肥大，腎小球直徑為31.6±1.7μm，仍然顯著高于對照小鼠（26.4±1.4μm），差異有統計學意義（P=0.016），而且部分腎小球出現系膜基質增多（見圖5C）。

圖5 db/db小鼠和對照小鼠的腎臟病理表現及腎小球直徑（PAS×100）

3 討論

小鼠GFR 的檢測受到其血、尿標本量少的限制，傳統的GFR 檢測方法如菊粉清除率、肌酐清除率等實施難度較大[1，2]，一些新型的檢測方法如經皮小鼠GFR 檢測方法[3]、近紅外光熒光分析檢測法[4]則需特殊儀器才能實現。國外文獻報道的使用FITC 菊粉通過檢測血漿中熒光衰減速率計算GFR 的方法具有一定優勢[5，7]，并且在為數不多的幾項研究中得到應用[8～10]，但是相關報道仍然較少，尤其在國內更未查到。可能的原因有：（1）既往的文章對該方法原理、操作過程及計算方法的描述欠清晰；（2）由于小鼠采血困難，在本文作者嘗試的過程中，發現個別時間點如果采血不成功將導致本次GFR 檢測整體失敗，增加了實驗難度。因此，我們仔細學習并復制該方法之后通過總結和改進，摸索出改良版的FITC-菊粉清除率測定方法，較原方法更為準確，并具有更好的可操作性。第1min 和第2min 的熒光數據缺失對檢測的準確性影響最大，文中作了詳細描述，供國內學者參考。

db/db 小鼠是一種先天性2 型糖尿病小鼠，也常被用于糖尿病腎病相關的研究[11，12]。本文觀察到db/db 小鼠在28 周齡內腎臟損傷的變化，使用改良的FITC-菊粉清除率測定方法檢測GFR 動態改變，同時觀察20周齡和28周齡時尿蛋白水平和腎臟病理表現，證實db/db 小鼠在20 周齡以后出現腎小球高濾過、微量白蛋白尿以及腎小球肥大、系膜基質增多等糖尿病腎病的早期表現。

3.1 檢測原理的解讀

FITC-菊粉注射之后血漿熒光值隨時間的變化曲線符合藥代動力學中常用的兩室模型（twophase exponential decay）。其中快速衰減相（分布相）血藥濃度下降很快，主要源于2 個途徑，一個是藥物從血管內轉移到血管外造成的血藥濃度顯著下降，另一個是機體代謝和排泄的消除；而慢速衰減相（消除相）曲線較為平坦，是因為藥物在血管內外分布已達到平衡，僅有藥物的代謝和排泄因素主要參與血藥濃度的下降，菊粉在體內的代謝符合這一規律。曲線的橫坐標為時間（tx），縱坐標為血漿中檢測到的熒光強度（Y）。該模型的曲線函數是Y=Ae-αtx+Be-βtx+平臺值。因在180min 后認為菊粉已經完全清除，血藥濃度接近于0，故平臺值是0，函數簡化為Y=Ae-αtx+Be-βtx。GFR=I/（A/α+B/β），具體計算見方法部分。

3.2 靜脈注射部位的選擇

小鼠靜脈注射的傳統方式是尾靜脈注射，但小鼠的尾靜脈較細，穿刺失敗率高，即使成功，因管徑太細，注射時間較長，不能滿足本研究彈丸式注射的要求。而且在清醒狀態下，小鼠尾部不易固定，極易跑針，難以保證藥物劑量。內眥靜脈叢注射是近年來新興的小鼠靜脈注射方式，其優勢是操作簡便、成功率高、能夠完成短時間大劑量注射，平均注射100μl 液體僅需1.49s，10 次注射的成功率能夠達到100%[13]。本研究采用內眥靜脈注射，在預實驗充分練習注射后，正式實驗注射成功率也接近100%。需要注意的操作要點是，充分固定小鼠頭部，使眼球突出，于內眥區域斜行負壓進針，刺入眼球后方，進針深度為2～3mm，避免傷及眼球，見回血時進行注射，注射完畢后迅速放開小鼠、解除頭部的壓力，避免藥液及血液外流。

3.3 檢測開始前增加灌胃步驟

因檢測過程長達75min，小鼠因緊張等因素飲水進食量均較小，為避免有效循環血量改變對GFR的影響，增加飲用水灌胃步驟。此外，糖尿病小鼠對水的需求較高，測試開始前灌注飲用水可避免脫水等不良事件的發生。

3.4 熒光檢測儀器和采血量的改進

文獻中的熒光檢測使用的是分光光度計，所需檢測樣本體積相對較大，且每次測量樣本量有限。因本實驗嘗試使用的熒光酶標儀，精確度較高且樣本的最小體積能夠達到40μl，在預實驗中小鼠血漿成倍稀釋后熒光測定值的線性關系良好，故本實驗將每次的采血量降低到5μl，以最大限度減少對循環血量的影響。此外，該儀器可使用96孔板檢測，使得同時檢測的樣本量大大提升。

3.5 對檢測時間點的改進

文獻報道的采樣時間大多為3、7、10、15、35、55 及75min 共7 個時間點[5]，但我們在預實驗中發現僅有7 個時間點不能保證每只檢測的小鼠得到符合兩室模型曲線，有時GRAPH Pad Prism 8.0會出現“Ambiguous”字樣。此時得到的參數計算結果誤差很大，尤其當個別時間點采樣失敗時更易出現這種情況。因此，我們增加了檢測時間點。由于在前幾分鐘內血漿熒光值衰減速率較快，因此為得到更準確的曲線，我們在前5min 內每min進行檢測，將時間點增加至11個，所有曲線未再出現“Ambiguous”字樣，且減少任意1 個時間點仍能得到合格曲線，除第1min和第2min的檢測結果缺失會產生有統計學意義的差異，其他時間點某一個數據缺失對GFR 結果影響不大。此外，在非同日重復檢測同一只小鼠的GFR，差異無統計學意義，提示該方法具有良好的操作性和可重復性。

3.6 db/db小鼠高濾過狀態的觀察

糖尿病腎病最早期的表現為腎小球高濾過，之后隨著尿蛋白的增多，GFR逐漸下降，但國內缺少對糖尿病小鼠GFR 的觀察。本文使用先天性2型糖尿病db/db 小鼠作為糖尿病小鼠模型，在28周齡內觀察其GFR 的變化，為日后研究糖尿病腎病早期高濾過狀態的機制打下基礎。本文觀察到從8 周齡開始，db/db 小鼠的GFR 均值雖高于對照組，但差異無統計學意義，到16 周齡和20 周齡，db/db 小鼠出現了具有統計學意義的高GFR 狀態，同時，在20 周齡以后db/db 小鼠出現微量白蛋白尿和輕度的腎臟病理損傷，符合糖尿病腎病的早期表現。

綜上所述，經過增加采血時間點、減少采血量、改進熒光檢測方法、檢測前增加飲用水灌胃步驟等措施改良的FITC-菊粉清除率測定是一種更為準確、穩定的檢測清醒小鼠GFR 的方法，具有較高的應用價值。經過28周的觀察，證實db/db小鼠在20 周齡以后出現腎小球高濾過、微量白蛋白尿以及腎小球肥大、系膜基質增多等病理損傷，該小鼠可作為研究糖尿病腎病早期的動物模型。