長鏈非編碼RNA COL11A1-208對口腔鱗癌細胞增殖及侵襲的影響

蔣英英，陳曦，石雨，應濟丞，王笑笑，丁剛*

1濰坊醫學院口腔醫學院，山東 濰坊 261053；2濰坊醫學院附屬醫院口腔科，山東 濰坊 261035

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC，簡稱口腔鱗癌)是頭頸部表皮的常見惡性腫瘤之一[1]，因其局部復發率和轉移率高，預后差，嚴重影響患者的健康和生活質量[2-3]。對口腔鱗癌生長和轉移機制的探究，有利于推動其預防和治療的進步，具有重要的科學意義和應用價值。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是長度大于200個核苷酸，但缺乏蛋白質編碼潛能的RNA轉錄產物，可參與DNA復制、RNA轉錄、蛋白質翻譯、細胞發育和分化等，是細胞生物學過程的重要調節因子[4-5]。以往研究顯示，口腔鱗癌細胞和組織內高表達的lncRNA可促進口腔鱗癌細胞的增殖和轉移，可能成為預測口腔鱗癌預后的候選分子標記物或靶向治療的潛在靶標[6-8]。本研究前期利用基因芯片與生物信息學技術對6例口腔鱗癌與癌旁正常組織lncRNA表達譜的篩選結果顯示，COL11A1-208(ENST00000470170)在口腔鱗癌組織內高表達，且與口腔鱗癌的不良預后相關[9]；然而，COL11A1-208在口腔鱗癌細胞中的表達及作用尚不清楚。本研究旨在通過觀察COL11A1-208在口腔鱗癌細胞內的表達、定位，及其表達改變對口腔鱗癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響，分析COL11A1-208在口腔鱗癌發生發展中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 達爾伯克改良伊格爾培養基(DMEM)、DMEM/F12(1:1)培養基、胎牛血清、0.25% EDTA胰蛋白酶溶液、青霉素-鏈霉素(100×)雙抗溶液均購自美國Gibco公司；重組人表皮生長因子(rEGF)、角質細胞無血清培養基(KSF)、聚氰基丙烯酸正丁脂(BCA)試劑盒、RNA核質分離試劑盒(PARISTMKit)、脂質體3000轉染試劑(LipofectamineTM3000)均購自美國Thermo Fisher Scientific公司；TRIzol試劑、PrimerScript-RT試劑盒、實時熒光定量PCR(qPCR)試劑盒(TB Green Premix Ex Taq reagent kit)購自日本TaKaRa公司；Cell Count Kit 8(CCK-8)試劑購自日本同仁化學研究所；脫脂奶粉、Matrigel基質膠購自美國BD Biosciences公司；ECL超敏發光液、Transwell小室購自美國Millipore公司；PBS緩沖液、TBST緩沖液購自北京索萊寶科技有限公司；無血清細胞凍存液購自蘇州新賽美生物科技有限公司；聚凝胺(polybrene)基因轉染增強劑購自上海翊圣生物科技有限公司；熒光原位雜交(FISH)試劑盒購自廣州銳博生物科技有限公司；嘌呤霉素(puromycin)、5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、DNase Ⅰ、4%多聚甲醛固定液、0.5%結晶紫均購自上海碧云天生物科技有限公司；Ⅺ型膠原α1鏈(collagen type Ⅺ alpha 1 chain，COL11A1)重組蛋白、上皮鈣黏素(E-cadherin)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、Ki-67抗體以及HRP-IgG H＆L山羊抗兔多克隆抗體購自美國Abcam公司；波形蛋白(vimentin)抗體購自美國CST公司。6孔板、24孔板、96孔板、培養皿及離心管等耗材均購自美國康寧公司。qPCR 儀(ABI 7500 FAST)購自美國Life Technologies公司；激光共聚焦顯微鏡、倒置顯微鏡、正置顯微鏡購自德國Leica公司；臺式離心機購自德國Eppendorf公司；多功能酶標儀(SpectraMax i3)購自美國Molecular Devices公司；電泳儀及凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司。本研究采用的引物、COL11A1-208Smart Silencer、動物實驗用反義寡核苷酸(ASO)及其陰性對照(negative control，NC)、COL11A1-208的Cy3 FISH探針均由廣州銳博生物科技有限公司設計合成；COL11A1-208及其NC質粒的構建及慢病毒包裝均由漢尹生物科技(上海)有限公司完成。

1.2 細胞實驗

1.2.1 細胞來源 采用的人口腔鱗癌細胞系(CAL27、HN4、HN6、HN30、SCC-4、SCC-9、SCC-25)均來自上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院口腔腫瘤生物學實驗室，正常對照細胞為人口腔黏膜上皮細胞原代培養獲得[4-5]。

1.2.2 細胞培養 細胞培養的方法參考以往研究[6-7]。HN4、HN6、HN30和CAL27細胞系在DMEM培養基中培養，SCC-4、SCC-9和SCC-25細胞系在DMEM/F12(1:1)培養基中培養。培養基均加入10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素。口腔黏膜上皮細胞原代培養在含0.2 ng/ml rEGF的角質細胞無血清培養基中進行，培養箱條件為37 ℃、濕度95%、5% CO2。密切觀察細胞生長狀態，根據細胞狀態每隔2～3 d換液；細胞生長至約90%融合時，使用0.25%胰蛋白酶進行消化傳代，用于后續實驗或凍存后備用。

1.2.3 RNA提取、反轉錄及qPCR實驗 采用TRIzol試劑分離培養細胞的總RNA。用PrimerScript-RT試劑盒進行cDNA反轉錄。使用qPCR試劑盒配制20 μl反應體系。使用ABI StepOne qPCR儀進行qPCR實驗。反應條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環。PCR反應以GAPDH和(或)U6作為內參，相對表達量采用2–ΔΔCt法計算。引物序列見表1。

表1 qPCR所用引物序列Tab.1 Primer sequences for qPCR

1.2.4 RNA核質分離及FISH實驗檢測COL11A1-208的亞細胞定位 使用RNA核質分離試劑盒分離細胞核、質RNA，細胞核、質RNA和總RNA經過純化和DNase Ⅰ處理后進行反轉錄，用COL11A1-208引物進行qPCR檢測，根據以下公式：所占比例(%)=2(總RNA的Ct值－組分RNA的Ct值)×100%，判斷COL11A1-208在細胞核、質RNA內的分布比例。U6作為細胞核的內源性對照，GAPDH作為細胞質的內源性對照，兩者的分布比例用于判斷RNA核質分離的效果。另外，使用RiboTMFISH試劑盒及Cy3熒光標記的COL11A1-208FISH探針進行FISH實驗，采用激光共聚焦顯微鏡觀察COL11A1-208在細胞中的定位情況。

1.2.5 細胞轉染及COL11A1-208敲減效率驗證將處于對數生長期的待轉染CAL27、HN4細胞按每孔2×105個細胞接種于6孔板，搖勻后置培養箱內培養過夜；按照脂質體3000轉染試劑說明書分別向CAL27、HN4細胞轉染COL11A1-208 Smart Silencer(SS-COL11A1-208)或陰性對照片段Smart Silencer(SS-NC)。轉染48 h后用qPCR法進行基因敲減效率檢測，達到預定的基因敲減效果后進行后續實驗。COL11A1-208沉默及動物實驗用ASO的靶序列見表2。

表2 COL11A1-208沉默及動物實驗用ASO的靶序列Tab.2 Target sequences of COL11A1-208 Smart Silencer and ASO for animal experiments

1.2.6COL11A1-208過表達慢病毒穩轉株構建及效率驗證COL11A1-208慢病毒載體構建信息如下：基因名稱COL11A1-208(ENST00000470170)；載體元件順序CMV-MCS-PGK-Puro；克隆位點XhoⅠ/EcoR Ⅰ。慢病毒轉染具體方法參照以往研究[4-5]。將處于對數生長期的HN4、HN6細胞計數后，按每孔2×105個細胞接種于6孔板，搖勻后置培養箱內培養過夜；使用polybrene基因轉染增強劑(終濃度10 μg/ml)進行COL11A1-208過表達慢病毒細胞感染。經嘌呤霉素(終濃度10 μg/ml)篩選2或3次，3 μg/ml嘌呤霉素維持培養2周，建立COL11A1-208過表達慢病毒穩轉株(LV-COL11A1-208)。陰性對照載體慢病毒穩轉株(LV-NC)流程同上。提取LV-COL11A1-208組和LV-NC組細胞RNA后進行反轉錄，采用qPCR檢測COL11A1-208穩轉株的過表達效率。

1.2.7 CCK-8法檢測細胞增殖能力 將COL11A1-208敲減或過表達細胞接種到96孔板，密度為每孔約1×103個細胞，每組設3個復孔，每日檢測細胞活性。將10 μl CCK-8試劑加入100 μl培養基，細胞37 ℃持續孵育2 h后，使用多功能酶標儀檢測450 nm波長處的吸光度(OD)。連續檢測5 d，使用Graphpad Prism 7.0軟件，以細胞生長時間為橫坐標、OD值為縱坐標繪制生長曲線。

1.2.8 平板克隆形成實驗檢測細胞克隆形成能力將COL11A1-208敲減或過表達細胞接種到6孔板，每孔1×103個細胞，培養10～14 d形成細胞集落。將細胞集落用PBS洗滌2次，4%多聚甲醛固定液固定15 min，0.5%結晶紫染色30 min。對細胞數目>50的集落進行計數。

1.2.9 Transwell法檢測細胞遷移及侵襲能力COL11A1-208敲減或過表達細胞消化后，采用無血清DMEM培養基重懸并計數，每上室接種2.5×104個/100 μl細胞，每組設置4個復孔。遷移實驗直接使用未處理的Transwell小室，侵襲實驗采用包被Matrigel基質膠的Transwell小室。下室加入600 μl含10%胎牛血清的DMEM培養基，37 ℃培養箱中培養24～48 h；4%多聚甲醛溶液固定、0.5%結晶紫染色后，用棉簽擦去膜上表面的非侵入細胞；高倍鏡下觀察并進行穿膜細胞計數。隨機取5個視野進行拍照，細胞計數取平均值，以計數所得細胞數的相對數代表癌細胞的遷移和侵襲能力。

1.2.10 Western blotting檢測COL11A1蛋白和上皮-間充質轉化(EMT)相關蛋白(上皮鈣黏素、波形蛋白)的表達水平 Smart Silencer轉染細胞72 h后或慢病毒穩轉株細胞的密度達80%～90%時，PBS緩沖液洗滌細胞3次，加入適量全細胞裂解液裂解細胞；充分裂解后，蛋白裂解液105 ℃煮10 min，–80 ℃保存蛋白樣品。使用BCA試劑盒測定蛋白濃度，加SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，105 ℃煮10 min，冰上備用。配膠后上樣，10% SDS-PAGE凝膠電泳，300 mA轉膜2 h，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。一抗[COL11A1(1:1000)、E-cadherin(1:500)、波形蛋白(1:1000)、GAPDH(1:1000)]4 ℃搖床孵育過夜。次日TBST洗3次，二抗室溫孵育1 h；TBST洗3次后，用ECL超敏發光液進行顯影。采用Image J軟件測量Western blotting條帶的灰度值，以GAPDH為內參分析蛋白的相對表達量。

1.3 動物實驗

1.3.1 實驗動物 5周齡的BALB/C-nu雄性裸鼠8只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[實驗動物生產許可證號：SCXK(京)2021-0006]。本研究經濰坊醫學院實驗動物倫理委員會審批同意(批準文號：2019SDL008)，實驗過程符合國家和單位有關實驗動物的管理和使用規定。

1.3.2COL11A1-208敲減的裸鼠皮下移植瘤實驗5周齡的雄性裸鼠4只，隨機分為ASO-COL11A1-208組和ASO-NC組，每組2只；每只裸鼠均做標記，備用。收集處于對數生長期的CAL27細胞，用無血清DMEM培養基將其重懸并計數，將密度調至2×107個/ml；用注射器將100 μl細胞懸液注射于裸鼠的上肢兩側背部皮下。裸鼠飼養約1周后可見瘤體形成，分別向兩組瘤內注射5 nmol/50 μl膽固醇和甲基化修飾的ASO-COL11A1-208或ASO-NC，每4 d注射1次，共注射5次；定期觀察瘤體生長情況。飼養28 d后結束觀察，將裸鼠安樂死，取下完整瘤體，拍照并測量腫瘤重量和體積。

1.3.3COL11A1-208過表達的裸鼠皮下移植瘤實驗

5周齡的雄性裸鼠4只備用。分別收集處于對數生長期的LV-COL11A1-208組及LV-NC組的HN6細胞，用無血清DMEM培養基重懸并計數，將細胞懸液密度調至2×107個/ml，用注射器分別注射100 μl細胞懸液于裸鼠下肢左、右兩側背部皮下(左側為LV-NC組，右側為LV-COL11A1-208組)。裸鼠飼養約1周后可見瘤體形成，定期觀察移植瘤的生長情況。飼養至21 d結束觀察，將裸鼠安樂死，取腫瘤組織拍照并測量腫瘤重量和體積。

1.3.4 組織學觀察 將瘤體于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，經脫水、石蠟包埋、切片后進行HE染色，并使用Ki-67抗體進行免疫組織化學(immunohistochemistry，IHC)染色，顯微鏡下觀察并拍照。1.4 統計學處理 采用SPSS 16.0軟件進行統計分析，以Graphpad Prism 7.0軟件制圖。計量資料以±s表示，符合正態分布并滿足方差齊性時，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1COL11A1-208在7個口腔鱗癌細胞系中的表達情況 qPCR檢測結果顯示，口腔鱗癌細胞系中COL11A1-208相對表達水平均明顯高于正常對照細胞(圖1)，其中，CAL27、HN30細胞中相對表達水平較高(P＜0.05)，HN4、SCC-9細胞中相對表達水平中等(P＜0.01)，HN6、SCC-4、SCC-25細胞中相對表達水平較低(P＜0.05)。本研究選用CAL27、HN4和HN6共3個口腔鱗癌細胞系進行COL11A1-208的后續研究。

圖1 qPCR檢測COL11A1-208在7個口腔鱗癌細胞系中的表達Fig.1 Expression of COL11A1-208 in OSCC cell lines detected by qPCR

2.2COL11A1-208在口腔鱗癌細胞中的亞細胞定位 將CAL27、HN4、HN6細胞進行RNA核質分離(以U6、GAPDH作為內參驗證分離效果)后行qPCR檢測，結果顯示，COL11A1-208主要定位于口腔鱗癌細胞核內(P＜0.01，圖2A)。FISH實驗亦顯示COL11A1-208定位于細胞核(圖2B)。

圖2 RNA核質分離和FISH實驗檢測COL11A1-208的亞細胞定位Fig.2 Subcellular localization of COL11A1-208 detected by nucleocytoplasmic RNA isolation and FISH assay

2.3COL11A1-208敲減對口腔鱗癌細胞增殖及克隆形成能力的影響 qPCR檢測結果顯示，SSCOL11A1-208組細胞COL11A1-208相對表達量均明顯低于SS-NC組(P＜0.01，圖3A)。CCK-8法檢測結果顯示，SS-COL11A1-208組細胞增殖活性明顯低于SS-NC組(P＜0.05，圖3B)。平板克隆形成實驗結果顯示，SS-COL11A1-208組細胞的克隆形成能力明顯低于SS-NC組(P＜0.0001，圖3C)。

圖3 COL11A1-208敲減對口腔鱗癌細胞增殖及克隆形成能力的影響Fig.3 Effect of COL11A1-208 downregulation on the proliferation and colony formation of OSCC cells

2.4COL11A1-208敲減對口腔鱗癌細胞遷移和侵襲能力的影響 Tanswell遷移實驗結果顯示，COL11A1-208敲減的CAL27、HN4細胞穿膜數均明顯少于SS-NC組(P＜0.05，圖4A)；Transwell侵襲實驗呈現出一致的結果(P＜0.01，圖4B)。

圖4 COL11A1-208敲減對口腔鱗癌細胞遷移和侵襲能力的影響Fig.4 Effect of COL11A1-208 downregulation on the migration and invasion of OSCC cells

2.5COL11A1-208過表達對口腔鱗癌細胞增殖及克隆形成的影響 qPCR檢測結果顯示，LVCOL11A1-208組細胞COL11A1-208相對表達量均明顯高于LV-NC組(HN6：6524.216±3395.926vs.1.000±0.000；HN4：3486.230±743.908vs.1.000±0.000；P＜0.05，圖5A)。CCK-8法檢測結果顯示，LV-COL11A1-208組細胞的增殖活性明顯高于LV-NC組(HN6：OD2d值1.012±0.056vs.0.701±0.012，P＜0.001；OD5d值2.345±0.095vs.1.476±0.114，P＜0.05；HN4：OD2d值0.694±0.065vs.0.569±0.028，P＜0.05；OD5d值2.150±0.131vs.1.229±0.131，P＜0.01，圖5B)。平板克隆形成實驗結果顯示，LV-COL11A1-208組細胞克隆形成能力明顯高于LV-NC組(HN6細胞克隆數：177.667±23.587vs.86.667±12.583，P＜0.01；HN4細胞克隆數：367.000±14.107vs.206.000±21.166，P＜0.001，圖5C)。

圖5 COL11A1-208過表達對口腔鱗癌細胞增殖、克隆形成能力的影響Fig.5 Effect of COL11A1-208 upregulation on the proliferation and colony formation of OSCC cells

2.6CO L 1 1 A 1-2 0 8過表達對口腔鱗癌細胞遷移和侵襲能力的影響 Transwell遷移實驗結果顯示，COL11A1-208過表達的HN6、HN4細胞穿膜數明顯多于LV-N C 組(H N 6 遷移細胞數：1045.349±58.072vs.600.195±18.259；HN4遷移細胞數：642.830±30.836vs.373.784±7.416；P＜0.0001，圖6A)；Transwell侵襲實驗結果與遷移實驗結果一致(HN6侵襲細胞數：975.349±22.769vs.573.529±32.292；HN4侵襲細胞數：542.830±30.836vs.307.118±14.967；P＜0.0001，圖6B)。

圖6 COL11A1-208過表達對口腔鱗癌細胞遷移和侵襲能力的影響Fig.6 Effect of COL11A1-208 upregulation on the migration and invasion of OSCC cells

2.7COL11A1-208與COL11A1表達的相關性

qPCR和Western blotting檢測結果顯示，SSCO L 1 1 A 1-2 0 8 組 細 胞 內CO L 1 1 A 1相 對 表 達 量均明顯低于SS-NC組(CAL27：0.540±0.090vs.1.000±0.000，P＜0.05；HN4：0.434±0.119vs.1.000±0.000，P＜0.01)，COL11A1蛋白相對表達量均明顯低于SS-NC組(CAL27：0.439±0.082vs.1.341±0.125，P＜0.001；HN4：0.129±0.032vs.0.660±0.027，P＜0.0001，圖7A)。LV-COL11A1-208組細胞內COL11A1相對表達量均明顯高于LV-NC組(HN6：6.098±0.962vs.1.000±0.000，P＜0.001；HN4：30.172±8.242vs.1.000±0.000，P＜0.01)，COL11A1蛋白相對表達量均明顯高于LV-NC組(HN6：0.679±0.018vs.0.330±0.011，P＜0.0001；HN4：0.942±0.019vs.0.709±0.025，P＜0.001，圖7B)。

圖7 COL11A1-208表達改變對口腔鱗癌細胞COL11A1 mRNA及蛋白表達的影響Fig.7 Effect on the mRNA and protein expression of COL11A1 in OSCC cells by change of COL11A1-208 expression

2.8CO L 1 1 A 1-2 0 8表達改變對口腔鱗癌細胞EMT相關蛋白(上皮鈣黏素、波形蛋白)的影響Western blotting檢測結果顯示，SS-COL11A1-208組細胞的上皮鈣黏素相對表達量明顯增高(CAL27：0.782±0.077vs.0.618±0.051，P＜0.05；HN4：1.164±0.048vs.0.768±0.103，P＜0.01)，而波形蛋白相對表達量明顯降低(CAL27：0.131±0.028vs.0.527±0.158，P＜0.05；HN4：0.240±0.021v s.0.4 9 3±0.0 2 9，P＜0.0 0 1，圖8 A)。而LVCOL11A1-208組細胞的上皮鈣黏素相對表達量明顯降低(P＜0.05)，而波形蛋白相對表達量明顯增高(P＜0.01，圖8B)。

圖8 COL11A1-208表達改變對口腔鱗癌細胞內上皮鈣黏素和波形蛋白表達的影響Fig.8 Effect on expression of E-cadherin and Vimentin in OSCC cells by change of COL11A1-208 expression

2.9COL11A1-208表達改變對裸鼠皮下移植瘤生長的影響 CAL27細胞皮下移植瘤內定期注射ASOCOL11A1-208觀察COL11A1-208敲減對裸鼠皮下移植瘤生長的影響，結果顯示，COL11A1-208敲減的CAL27細胞形成的移植瘤重量、體積均明顯小于ASONC組[重量：(0.070±0.026) gvs.(0.268±0.146) g，P＜0.0 5；體積：(4 5.6 2 5±1 3.0 0 9) m m3v s.(119.000±31.528) mm3，P＜0.01，圖9A－B)；瘤體組織HE和Ki-67染色后組織學形態觀察結果顯示，COL11A1-208敲減CAL27細胞形成的移植瘤較ASONC組生長減緩(圖9C)。此外，COL11A1-208過表達的HN6細胞形成的裸鼠皮下移植瘤明顯大于LV-NC組[重量：(0.485±0.140) gvs.(0.248±0.135) g，P＜0.0 5；體積：(9 8.7 6 6±2 6.2 4 6) m m3v s.(48.313±24.435) mm3；P＜0.05，圖9D－E]；瘤體組織HE和Ki-67染色后組織學形態觀察結果顯示，COL11A1-208過表達的HN6細胞形成的移植瘤較LV-NC組生長加快(圖9F)。

圖9 COL11A1-208表達改變對口腔鱗癌細胞形成的裸鼠皮下移植瘤生長的影響Fig.9 Effect on growth of OSCC xenograft tumor in vivo by change of COL11A1-208 expression

3 討 論

腫瘤發生發展涉及一系列復雜的過程，與表觀遺傳修飾、非編碼RNA等多種因素有關[10]。近年來，lncRNA在惡性腫瘤中的作用及機制成為研究的熱點。文獻報道lncRNAs在惡性腫瘤中的異常表達往往與腫瘤的侵襲、轉移相關，這些lncRNAs具有成為靶向治療靶標和預后分子標記物的潛力[11]。

大量研究顯示，多種lncRNAs在口腔鱗癌的腫瘤組織中表達異常，如CCAT2、AFAP1-AS1、meg3、HOTAIR和FAL1等，且與口腔鱗癌患者的臨床病理特征相關，提示lncRNA可能成為口腔鱗癌的輔助診斷指標[12-17]。腫瘤轉移是影響口腔鱗癌預后的危險因素，而lncRNA在口腔鱗癌侵襲、轉移中的作用和機制越來越受關注[18]。已有研究顯示，部分lncRNAs能夠促進口腔鱗癌的侵襲與轉移，但相關機制尚不明確[19-21]。本課題組前期研究發現，多種lncRNAs(如LINC00460、KTN1-AS1、lnc-H2AFV-1等)可通過與蛋白互作、吸附微小RNA(miRNA)或調控m6A RNA甲基化等機制影響口腔鱗癌細胞的增殖或轉移，在口腔鱗癌的發生發展中發揮重要作用[6-8]。由此可見，與口腔鱗癌細胞增殖和侵襲相關的lncRNAs有望成為口腔鱗癌輔助診斷的分子標記物和靶向治療的潛在靶點，對口腔鱗癌的診治具有潛在的臨床價值。

本課題前期研究顯示，COL11A1-208在口腔鱗癌組織中高表達，且與患者的不良預后相關[9]。本研究結果顯示，COL11A1-208在口腔鱗癌細胞中呈高表達，與在口腔鱗癌組織中的研究結果一致；體外實驗和動物體內實驗結果均顯示其可促進口腔鱗癌的增殖和侵襲能力，為臨床上篩選和鑒定診治口腔鱗癌的分子標記物提供了實驗依據。COL11A1-208定位于1號染色體102 877 717－102 880 018反鏈，由兩個外顯子組成，是COL11A1的轉錄本之一。近年有研究顯示，COL11A1基因異常表達與多種腫瘤(如頭頸鱗癌、卵巢癌、甲狀腺癌等)的發生發展相關，在細胞增殖、侵襲和化療耐藥等生物學過程中起著重要作用，可能成為腫瘤預后預測和診斷治療的潛在分子標記物[22]。以往研究發現，COL11A1在口腔鱗癌組織和細胞中呈高表達，且COL11A1基因表達下調后口腔鱗癌細胞的增殖和侵襲能力明顯減弱[23]，這與本研究中COL11A1-208在口腔鱗癌細胞的表達和功能表現一致。另外，本研究結果顯示，COL11A1-208主要定位于口腔鱗癌細胞的細胞核，雖然不能編碼蛋白，但其表達水平的改變可調控COL11A1的表達。這可能與胞核lncRNA的表觀遺傳調控機制有關，如lncRNAs與啟動子或增強子等相關的不穩定轉錄本能夠選擇性結合在染色質上，參與調控染色質結構、轉錄和RNA加工等過程[24-25]。

本研究結果還顯示，COL11A1-208敲減后口腔鱗癌細胞上皮標志物上皮鈣黏素表達升高、間充質標志物波形蛋白表達降低，而COL11A1-208過表達細胞的上皮鈣黏素表達降低、波形蛋白表達升高。這一系列結果提示，COL11A1-208可促進口腔鱗癌細胞EMT的發生。EMT作為一種可逆的細胞程序，可使上皮細胞瞬間進入準間充質細胞狀態[26]，與腫瘤的發生、進展和細胞遷移、侵襲等相關[27-28]。LncRNA在EMT過程中可發揮重要作用，因此常被認為是預測EMT發生和腫瘤轉移的生物標志物及靶向治療的潛在靶點[29]。因此，明確COL11A1-208對EMT的調控作用可為今后進一步深入探討相關機制打下基礎。

總之，本研究結果表明，COL11A1-208作為參與調控口腔鱗癌細胞增殖、侵襲、轉移的lncRNA，可能成為口腔鱗癌診斷和治療的分子靶標。