外泌體攜載MMPs在椎間盤退變中的作用研究進展

藺茂強，胡一村，張曉勃，安海英，郭濤文，高熙丹，張芮浩，陳祥義，于得臣，周海宇*

1蘭州大學第二醫院骨科，甘肅 蘭州 730030；2甘肅省骨關節疾病研究重點實驗室，甘肅 蘭州 730030；3西安紅會醫院骨科，陜西 西安 710000；4武漢大學中南醫院檢驗科，湖北 武漢 430000

下腰痛(low back pain，LBP)是目前全球致殘率最高的慢性疾病，據統計約有5.4億人正被腰痛疾病所困擾[1]。許多因素可造成LBP，其中椎間盤退變(intervertebral disc degeneration，IVDD)被認為是最主要的原因之一[2-4]。目前針對IVDD的治療包括非手術治療和手術干預，但均無法阻止疾病進展及恢復椎間盤重建[5]，而基于外泌體的生物療法在椎間盤再生方面具有良好的應用前景。近期研究發現，椎間盤細胞外基質(extracellular matrix，ECM)含量和組成的改變與IVDD的發生發展密切相關[6]。值得注意的是，ECM成分中的基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)在不同退變程度椎間盤ECM中的表達存在明顯差異[7]。雖然造成上述差異的具體機制尚未闡明，但隨著IVDD程度的加重，一系列MMPs的表達及活性增加，直接或間接參與了IVDD進程[8-9]。外泌體作為細胞間通訊和物質交換的小分子囊泡，通過在細胞與細胞、細胞與ECM之間輸送MMPs參與了IVDD的發生發展過程[10]。

近年來，外泌體因具有親代細胞生物學特性、低免疫原性和易存貯等優點[11]，在IVDD研究中取得了豐碩的成果，從而有望從生物分子水平治療IVDD。越來越多的證據表明，外泌體在細胞間通過傳遞MMPs等物質影響或改變椎間盤的ECM代謝，從而影響正常椎間盤細胞的生物學功能，進而參與機體的生理和病理過程[12]。本文總結目前已證實的外泌體攜載的MMPs在IVDD中的作用，旨在為外泌體及MMPs應用于IVDD的基礎及臨床研究提供理論基礎。

1 IVDD的病理機制

IVDD是多種機制共同參與導致的脊柱外科疾病，其具體病因及發病機制尚不明確，有研究發現，IVDD的發生與椎間盤細胞丟失、ECM成分改變密切相關[13-14]；而且在IVDD的發生過程中，有多種環境因素(如年齡增長、異常應力增加等)及遺傳因素等共同參與[15]。椎間盤是人體內完全封閉的無血管組織，由軟骨終板、外圍的纖維環和中央的髓核組成，缺少血液供應[16-17]，因此，ECM是椎間盤細胞賴以生存的細胞外微環境。

研究發現，ECM主要由蛋白多糖、水、膠原、少量彈性蛋白等成分組成，髓核細胞在這種微環境下可產生一種高度水合的基質，當脊柱承受壓力時髓核細胞發揮作用使椎間盤各部分受力均勻，以避免異常外力造成椎間盤結構的改變[18-19]。最新研究證實，MMPs作為一類蛋白水解酶，可通過降解椎間盤的ECM成分而加速IVDD進展[9]，而外泌體在此過程中發揮一定的橋梁作用[20]。由此可見，以外泌體和MMPs作為分子治療靶標，調節其表達水平，有望延緩ECM成分改變導致的IVDD進展。

2 外泌體參與椎間盤退變及修復

2.1 外泌體及其作用 外泌體最初是由Pan于1983年在綿羊的網織紅細胞中發現的，直徑為30～100 nm，在電子顯微鏡下表現為“杯狀”或“碟狀”，具有與細胞膜相似的磷脂雙分子層結構，這種雙層膜殼結構可防止其內容物在細胞間傳遞過程中被酶降解[21-22]。外泌體是由多囊泡小體途徑衍生而來的胞外小囊泡，產生于多囊泡內涵體(multivesicular endosomes，MVEs)或多囊泡體(multivesicular bodies，MVBs)，并在這些小室與質膜融合時分泌出來[23]。外泌體到達受體細胞并與受體細胞膜融合后，將所攜載的生物活性物質釋放到受體細胞或ECM中，從而發揮細胞間信號傳遞和物質交換的作用[24]。外泌體的信使作用是其攜載相關生物活性分子在IVDD中發揮作用的基礎，其有可能成為IVDD生物分子水平治療的新靶點[5]。

2.2 外泌體參與椎間盤退變及修復的潛在機制外泌體具有雙層膜殼結構，可維持其攜載的內容物在長距離運輸及與受體細胞相互作用過程中的穩定性，且與干細胞相比，更易在退變的椎間盤所產生的低細胞結構、低葡萄糖、高滲透壓、低pH值和低氧的惡劣環境中生存[25]，這些特性使其成為IVDD干細胞移植治療的潛在替代方案。

IVDD發生的主要原因是中央的髓核細胞凋亡增加、過度的氧化壓力、炎性因子的大量入侵，以及髓核中的ECM代謝紊亂等，其中ECM代謝紊亂被認為是引起IVDD最主要的機制[26]。研究證實，外泌體可通過miRNA等調控因子促進髓核中ECM的合成而延緩IVDD[27]，且可借助于攜載的生物活性物質調節免疫系統[28]，抑制髓核細胞凋亡和炎癥反應，促進髓核細胞增殖和再生，修復組織損傷，參與椎間盤的退變及修復過程[25,29]。

外泌體作為含有親代細胞成分的納米囊泡[30]，在細胞間通訊中發揮著重要的介質作用，其功能與親代細胞和攜載的內容物密切相關[25,31]。Sun等[32]觀察纖維環細胞衍生的外泌體(annulus fibrosus cell derived exosome，AF-exo)對人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)產生的效應，探討外泌體在IVDD血管化調節中的作用，結果顯示，退化的AF-exo可上調TNF-α、IL-6等炎性因子的表達，增強HUVECs的遷移能力，促進HUVECs的血管化，對椎間盤產生不利影響；而非退化的AF-exo表現出相反的效應，可維持椎間盤的無血管化，對椎間盤起著保護作用。近期研究發現，人尿源性干細胞衍生的外泌體可通過轉移母體蛋白-3(matrilin-3，MATN3)促進髓核細胞的增殖和ECM的合成，延緩IVDD[33]。Lu等[25]研究發現，間充質干細胞衍生的外泌體可增強髓核細胞中ECM的合成，實現退化椎間盤的自我修復。由此可見，外泌體在IVDD中的作用與其來源密切相關，不同來源的外泌體對椎間盤的作用不同，既可通過促血管化作用對椎間盤產生不利影響，也可通過促進ECM的合成和髓核細胞的增殖以及抑制髓核細胞的凋亡等對椎間盤起到保護作用。

3 外泌體攜載MMPs參與IVDD

3.1 MMPs MMPs屬于鋅依賴性蛋白水解酶家族，是降解ECM中各種蛋白組分(包括糖蛋白、蛋白多糖尤其是膠原)的關鍵物質。在機體正常的生理狀態下，這些酶的活性受自身激活機制和內源性金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)的調節。然而在病理狀態下，MMPs與TIMPs之間的平衡被打破，MMPs被多種因子(如血管內皮生長因子)激活，從而降解ECM，加速IVDD的進程[34-35]。盡管目前MMPs參與IVDD的具體機制仍不清楚，但最近研究發現，外泌體在這一過程中發揮了轉運作用[20]。

3.2 外泌體攜載的MMPs 外泌體可攜載相應的生物活性物質(包括蛋白質、核酸和脂質)對受體細胞產生一系列的影響，如細胞信號轉導、細胞黏附和遷移、細胞增殖和基因表達等[30,36-38]。研究證實，MMPs作為一類蛋白水解酶可被外泌體攜載，通過外泌體的傳遞在特定的受體細胞中發揮生物學作用[39]，如表1[38,40-48]所示。例如，Olejarz等[40]發現，腫瘤細胞來源的外泌體中富含MMPs，尤其是MMP-2、MMP-9、MMP-13，其通過外泌體的運輸到達腫瘤微環境，參與腫瘤血管生成，促進腫瘤細胞的遷移。Xu等[38]在胃癌患者血漿純化的外泌體中發現了MMP-11，并證實其可促進胃癌細胞的遷移。此外，MMP-1[41]、MMP-3[42]、MMP-13[43]、MMP-14[41,44]、MMP-19[41]也被證實存在于不同來源的外泌體中。由此可見，MMPs存在于外泌體中，雖然目前其發揮作用的具體機制仍不清楚，但對其作用機制的研究可能是深入了解外泌體治療IVDD的新途徑。

表1 外泌體攜載的MMPs及其生理效應Tab.1 MMPs carried by exosomes and their physiological effects

3.3 外泌體攜載MMPs調節ECM代謝 目前，對于外泌體攜載MMPs的研究主要集中在腫瘤領域，與IVDD相關的研究鮮少報道。MMPs作為一類蛋白酶，主要通過調節ECM的代謝參與IVDD。在正常健康椎間盤中，MMPs的分解代謝作用與組織的合成代謝活動處于一種平衡狀態；而在病理狀態下，MMPs的活性和表達出現失衡，分解代謝增強，從而導致ECM成分發生改變，最終加速椎間盤的病理改變[49]。下文總結了近年來外泌體攜載的參與IVDD的MMPs。

3.3.1 MMP-1、MMP-3 MMP-1、MMP-3均可在退變的椎間盤中表達，且其表達水平與椎間盤的退變程度存在明顯正相關關系[50]。Pohl等[45]將內皮細胞分泌的外泌體與纖維環細胞共培養后發現，MMP-1、MMP-3的表達明顯上調，并通過Western blotting檢測證實，過量表達的MMP-1、MMP-3一部分來自內皮細胞分泌的外泌體，另一部分來自纖維環細胞，而MMP-1、MMP-3過量表達導致纖維環細胞的基質分解代謝增強，破壞了椎間盤的基質穩態。此外，來自內皮細胞的外泌體可抑制纖維環細胞中蛋白聚糖基因的表達，促進新生血管的形成，加速椎間盤血管化。

Dean等[46]通過RT-PCR、酪蛋白酶譜分析和Western blotting檢測證實，MMP-3存在于軟骨細胞分泌的外泌體中，且其活性受維生素代謝物的調節。基于上述研究，Boyan等[51]發現，1,25(OH)2D3直接作用于外泌體表面的膜受體蛋白質二硫鍵異構酶A3，激活磷脂酶A2，產生溶血磷脂破壞外泌體膜的穩定性，釋放活性MMP-3，而后者可特異性水解軟骨細胞的ECM成分。由此可見，臨床上可通過制備靶向藥物等手段降低MMP-1、MMP-3的表達，抑制椎間盤的ECM降解，進而延緩IVDD的進展。

3.3.2 MMP-2、MMP-9、MMP-14 MMP-2、MMP-9是MMPs家族的重要成員，對椎間盤的穩態極為重要，均被稱為明膠酶，主要靶向ECM中的變性膠原蛋白[52]。有研究發現，MMP-2、MMP-9的表達水平與椎間盤退變程度呈正相關[53]。Taraboletti等[47]通過明膠酶譜分析、Western blotting和免疫金電鏡實驗分析證實，MMP-2、MMP-9存在于HUVECs產生的外泌體中，并證實外泌體攜載的MMP-2、MMP-9可增強內皮細胞的遷移能力，加速內皮細胞毛細血管樣結構的形成，而內皮細胞的這些改變可促進椎間盤血管化，加速IVDD進程[32]。此外，為了進一步了解MMP-9是否存在于外泌體內部，Silva等[48]利用成像流式細胞術和明膠酶譜分析在樹突狀細胞分泌的外泌體內部發現了具有活性形式的MMP-9，并證實其不僅通過重塑和降解ECM成分促進細胞遷移和侵襲，還可通過切割骨橋蛋白形成活性片段促進細胞遷移和侵襲。

Hakulinen等[44]利用免疫電鏡檢測到MMP-14在外泌體表面過量表達，而MMP-14可降解ECM中的膠原(Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型)、纖維連接蛋白、玻璃體連接蛋白和層黏連蛋白等，還能發揮脫落酶的作用，如裂解syndecan-1、細胞內黏附分子-1(intracellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、CD44并將他們從細胞表面釋放出來，從而改變椎間盤細胞的正常生物學活性[54]。由此可見，外泌體攜載的MMP-2、MMP-9、MMP-14可通過促進內皮細胞的遷移和ECM的分解代謝，加速IVDD的進展。因此，MMP-2、MMP-9、MMP-14可作為生物學指標預測IVDD的嚴重程度，且可通過降低其表達為IVDD的臨床治療和預防提供新方案。

除了上述5種MMPs可通過外泌體轉運形式參與IVDD過程外，MMP-8[55]、MMP-10[56]和MMP-12[57]已被證實直接或間接參與IVDD的發生發展，但其發揮作用是否通過外泌體的轉運有待進一步證實。隨著對MMPs和外泌體研究的不斷深入，其在IVDD過程中的作用機制將逐漸被闡明，這為從生物分子水平治療和預防IVDD提供了新思路。

4 外泌體攜載的MMPs在IVDD中的應用局限性

盡管外泌體攜載MMPs在IVDD中的研究不斷獲得認可，但目前尚存在以下問題亟需解決。首先，MMPs在IVDD過程中的作用機制尚不清楚。其次，由于目前提取外泌體技術的局限，很難以低成本高效獲得高純度外泌體，僅局限于高級平臺實驗室，并且外泌體的含量與細胞類型和狀態有關。由于外泌體是一個包含有生物活性物質的胞外囊泡，其內包含的各種小分子物質對于疾病發生發展的作用各不相同，有益和有害的遺傳物質并存，目前的技術尚不足以提取完整有效的功效性分子。最后，雖然外泌體攜載的MMPs已逐步應用于腫瘤的檢測和預防等方面，但在椎間盤領域的研究主要集中于體外細胞實驗，尚缺乏一定的理論基礎，并且其臨床應用操作仍缺乏統一標準。因此，進一步增強對外泌體攜載的MMPs在IVDD中的作用機制研究，對于從分子水平治療IVDD具有重要的意義。

5 總結與展望

綜上所述，外泌體作為由親代細胞分泌的細胞外囊泡，主要通過其攜載的內容物影響受體細胞的生物學活動。外泌體可通過轉移MATN3促進髓核細胞的增殖和ECM的合成，延緩IVDD，也可通過攜載MMPs加速ECM成分的降解、促進內皮細胞的遷移及椎間盤的血管化，進而加速IVDD，但目前外泌體延緩或加速IVDD的具體作用機制仍未闡明。此外，與IVDD的傳統治療相比，基于外泌體的分子治療具有阻止疾病進展、重建椎間盤的優勢和潛力，但目前研究仍處于起步階段，距離應用于IVDD的臨床治療仍存在諸多挑戰。進一步深化外泌體參與IVDD作用機制的研究，對于外泌體在IVDD治療中的應用及椎間盤的再生有著深遠的意義。