細胞型朊蛋白在結直腸癌中的表達及其與預后的關系

杜耀，陳海峰，李衛平，孔智淵，朱露露，王益

1南昌大學第一附屬醫院胃腸外科，江西 南昌 330006；2蘇州大學附屬太倉醫院(太倉市第一人民醫院)消化內科，江蘇太倉 215400；3蘇州大學附屬太倉醫院(太倉市第一人民醫院)胃腸外科，江蘇 太倉 215400；4蘇州大學附屬太倉醫院(太倉市第一人民醫院)病理科，江蘇 太倉 215400

結直腸癌(colorectal cancer，CRC)是常見的消化道惡性腫瘤，也是癌癥新發第三大病因、死亡第二大病因[1]，目前多數患者確診時已屬中晚期，該病早期診斷的缺失給外科行根治性手術帶來了極大的困難；盡管中晚期患者術后可輔以放化療，但總體療效不理想[2]，5年生存率僅約40%[3]。因此，尋找一種敏感度和特異度均較高的腫瘤標志物對CRC的早期診斷和預后判斷具有重要的臨床價值。朊蛋白(prion protein，PrP)是引起瘋牛病的致病體，包括細胞型(cellular prion protein，PrPC)和致病型(scrapie associated prion protein，PrPSc)兩種空間構象。有研究發現，PrPC在神經系統中發揮著重要作用，且在腫瘤的發生、增殖和轉移中扮演著重要角色，與腫瘤的多種惡性生物學行為關系密切[4]。本課題組前期研究發現，PrPC在胃腸癌組織中呈高表達，且其陽性表達與直腸癌淋巴結轉移、TNM分期及分化程度密切相關[5]。本研究探討了PrPC在CRC組織中的表達情況，并分析其與CRC臨床病理特征及預后的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2016年1月－2017年1月蘇州大學附屬太倉醫院(太倉市第一人民醫院)胃腸外科經手術切除的CRC標本50例及癌旁正常組織標本(距腫瘤組織2 cm以上) 30例。納入標準：臨床資料完整；術前未行放化療；術后經病理檢查確診并進行門診或電話隨訪。排除標準：術前或術中發現遠處轉移；行姑息性手術切除；合并其他部位惡性腫瘤。本研究經蘇州大學附屬太倉醫院(太倉市第一人民醫院)醫學倫理委員會審批(批號：KY-2020-15)。

1.2 主要試劑及儀器 兔抗人PrPC多克隆抗體(ab6664)購自美國Abcam公司；DAB顯色試劑盒(K5007)、EnVision抗鼠/兔通用型免疫組化檢測試劑盒購自丹麥Dako公司。半自動脫水機(TP1020)、全自動石蠟包埋機(EG1150)、全自動石蠟切片機(RM2235)購自德國Leica公司；尼康顯微攝影圖像處理軟件(H500S電子顯微鏡)購自日本Nikon公司。

1.3 免疫組化SP法檢測PrPC的表達 所有標本經石蠟包埋、切片(厚度4 μm)后，行免疫組化染色，按照免疫組化檢測試劑盒說明書步驟操作。以已知陽性CRC組織切片作為陽性對照，以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。

結果判定：顯微鏡下觀察細胞質和(或)細胞核呈棕色或黃色判定為陽性著色。隨機選取10個200倍視野，計數1000個細胞，并根據每個視野中陽性細胞數比例和染色程度進行評分：陽性細胞數比例＜10%記0分，10%～25%記1分，25%～50%記2分，50%～75%記3分，≥75%記4分。將CRC組織與陰性對照進行著色強度評分：無染色為陰性(0分)，細胞質和(或)細胞核呈淡棕色為弱陽性(1分)，棕色為陽性(2分)，深棕色為強陽性(3分)。根據陽性細胞數比例與染色強度評分的乘積將組織染色結果進行分級：0～1為陰性(–)，2～4為弱陽性(+)，5～8為陽性(++)，9～12為強陽性(+++)。陽性率(%)=(陽性例數+強陽性例數)/總例數×100%。所有免疫組化染色結果均由兩位病理醫師在不知任何臨床和病理資料的情況下以上述標準進行評估，如意見不一致則由第三位病理醫師進行判定。

1.4 根據該判定標準，PrPC陽性表達共34例(包括陽性26例，強陽性8例)，設為PrPC陽性表達組；PrPC陰性表達共16例(包括弱陽性11例，陰性5例)，設為PrPC陰性表達組。PrPC表達與臨床病理特征及預后的關系 采用Spearman檢驗分析CRC組織中PrPC陽性表達與臨床病理特征的相關性。隨訪截至2021年1月，應用Kaplan-Meier法分析PrPC表達與CRC患者預后的關系，應用多因素Cox比例風險回歸模型分析CRC預后的影響因素。

1.5 統計學處理 采用SPSS 17.0軟件進行統計分析。計數資料以例(%)表示，采用χ2檢驗比較CRC組織與癌旁正常組織PrPC陽性表達率的差異。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 CRC組織中PrPC的表達情況 PrPC在CRC組織及癌旁正常組織中存在不同程度的陽性表達，PrPC陽性染色主要位于細胞核(圖1A)。PrPC在癌旁正常組織中陽性表達率為20.0%(6/30)，在CRC組織中為68.0%(34/50)[結腸癌組織：67.9%(19/28)，直腸癌組織：68.2%(15/22)]，差異有統計學意義(χ2=17.28，P＜0.01，圖1B)。

圖1 PrPC在CRC組織中的表達情況(SP ×200)Fig.1 Expression of PrPC in colorectal cancer tissues (SP ×200)

2.2 CRC組織中PrPC陽性表達與臨床病理特征的關系 Spearman相關分析顯示，CRC組織中PrPC陽性表達與TNM分期、腫瘤浸潤深度、腫瘤分化程度、脈管侵犯及淋巴結轉移明顯相關(P＜0.05)，與年齡、性別、腫瘤位置及腫瘤最大徑無相關性(P>0.05，表1)。2.3 PrPC表達與CRC預后的關系 隨訪截至2021年1月，除1例失訪外，余49例獲得完整隨訪，隨訪時間為6～68個月，隨訪期間32例死亡，中位隨訪時間為48個月。Kaplan-Meier法分析顯示，PrPC陰性表達組患者的生存時間為(62.0±7.0)個月，5年總體生存率為50.3%；PrPC陽性表達組患者的生存時間為(45.0±4.1)個月，5年總體生存率為7.0%。兩組生存情況比較，差異有統計學意義(P=0.015，圖2)。

表1 CRC組織中PrPC陽性表達與臨床病理特征的關系[例(%)]Tab.1 Relationship between positive PrPC expression and clinicopathological features in colorectal cancer tissues [n(%)]

(續 表)

圖2 PrPC陽性表達和陰性表達CRC患者Kaplan-Meier生存曲線Fig.2 Kaplan-Meier survival curves for CRC patients with positive and negative expression of PrPC

2.4 CRC的預后影響因素分析 單因素分析結果顯示，TNM分期、脈管侵犯、淋巴結轉移及PrPC陽性表達與CRC的預后有關(P＜0.05)，年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤最大徑、腫瘤浸潤深度及腫瘤分化程度與CRC的預后無關(P>0.05，表2)。

將單因素分析中P＜0.1的變量[TNM分期(Ⅰ－Ⅱ期賦值為0，Ⅲ－Ⅳ期賦值為1)、腫瘤浸潤深度(T1－T2期賦值為0，T3－T4期賦值為1)、腫瘤分化程度(中/高分化賦值為0，低分化賦值為1)、脈管侵犯(有脈管侵犯賦值為0，無脈管侵犯賦值為1)、淋巴結轉移(有淋巴結轉移賦值為0，無淋巴結轉移賦值為1)及PrPC表達(陽性表達賦值為0，陰性表達賦值為1)]納入Cox回歸模型進行多因素分析，結果顯示，TNM分期和PrPC陽性表達是CRC患者預后的獨立影響因素(P＜0.05，表2)。

表2 CRC預后影響因素的單因素和多因素分析Tab.2 Univariate and multivariate analysis of the prognosis in colorectal cancer

3 討 論

Pr P C 是一種含有2 5 3 個氨基酸的蛋白質，由PRNP基因編碼，其N端含有5個八肽重復區，可結合Cu2+、Zn2+和Mn2+等金屬離子[6]。PrPC也是一種正常細胞廣泛表達的糖基化磷脂酰肌醇(glycophosphatidylinositol，GPI)錨定糖蛋白，在哺乳動物體內高度保守，在神經系統中分布最為廣泛，其次為胃腸道。既往研究發現，PrPC參與口腔癌[7]、CRC[8]、胃癌[9]、肺癌[10]及乳腺癌[11]等多種腫瘤的發生發展，且其表達與多種腫瘤細胞的耐藥、增殖、凋亡、遷移及侵襲等過程有關[12]。王敏等[7]研究發現，PrPC低表達可抑制口腔癌細胞的增殖、黏附、遷移及侵襲；動物實驗結果顯示，PrPC低表達可抑制裸鼠移植瘤的生長。Gil等[13]對乳腺癌細胞中的PrPC進行過表達及沉默，發現PrPC可通過激活ERK和NF-κB信號通路促進乳腺癌細胞的侵襲及遷移，且與乳腺癌的進展及預后不良相關。本團隊前期針對胃腸癌的研究發現，下調PrPC的表達對結腸癌HT29細胞的增殖無明顯影響，但可增加細胞對化療藥物順鉑的敏感性[14]；抑制PrPC的表達可促進順鉑誘導的胃癌細胞(SGC7901)和結腸癌細胞(HT29)凋亡，其機制可能與上調促凋亡蛋白Bax和caspase-3以及下調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達有關[15]。王偉建等[16]研究發現，PrPC表達下調后，CRC細胞(Lovo和SW480)的增殖和侵襲能力均明顯降低，表明PrPC表達與細胞增殖及侵襲密切相關，PrPC高表達可促進CRC細胞的增殖及侵襲。既往有研究發現，PrPC介導的胃癌耐藥與PI3K/Akt途徑激活密切相關，抑制PI3K/Akt途徑的活性可逆轉PrPC介導的胃癌耐藥[17]。Du等[18]發現，PrPC參與了CRC干細胞的轉移，其具體機制與PrPC通過ERK2信號通路介導上皮-間充質轉化過程有關。另有研究發現，使用多柔比星處理結腸癌LS174T細胞后，PrPC高表達可上調細胞中凋亡抑制蛋白XIAP的表達，抑制結腸癌細胞凋亡，表明PrPC可通過抵抗多柔比星誘導的細胞凋亡而促進結腸癌的進展[19]。上述研究提示，PrPC可能對癌癥的發生、進展及細胞耐藥有重要影響。

既往研究證實，PrPC在胃癌、胰腺癌及乳腺癌等組織和細胞中呈高表達[20-22]，且其表達水平明顯高于癌旁正常組織[23]。本研究結果顯示，PrPC在CRC組織及癌旁正常組織中均存在不同程度的陽性表達，且其在CRC組織中的陽性表達率明顯高于癌旁正常組織，提示PrPC陽性表達可能與CRC的發生發展有關。進一步探討CRC組織中PrPC陽性表達與臨床病理特征的關系發現，PrPC陽性表達與TNM分期、腫瘤浸潤深度、腫瘤分化程度、脈管侵犯及淋巴結轉移密切相關，其中CRC分期晚、腫瘤浸潤深度深、中/高分化、有脈管侵犯及淋巴結轉移的患者PrPC陽性表達率較高，表明隨著CRC的進展PrPC表達逐漸增高，與孫楊安等[23]、梁聰等[24]及鄭彥濤等[25]的研究結果一致。同時PrPC與胃癌[26]、胰腺癌[27]、頭頸部鱗狀細胞癌[28]及喉癌[29]的相關研究也得出了類似結論。最近王可楹等[30]發現，PrPC的表達與口腔癌分化程度及年齡相關，而與性別、腫瘤浸潤深度、TNM分期及淋巴結轉移無關，與上述研究結果存在較大差異。分析原因可能與納入研究的腫瘤部位和類型不同有關。因此，臨床有望通過測定PrPC的表達水平來判斷和評估CRC的侵襲程度及淋巴結轉移情況。Zhou等[31]對238例胃癌患者進行隨訪，發現PrPC高表達與胃癌預后不良相關；Du等[18]也發現，PrPC表達水平與CRC患者的生存率呈負相關；而Tang等[32]對480例胃癌患者進行研究發現，胃癌組織中PrPC的表達明顯下調，且PrPC表達下調與胃癌患者生存率低相關，這一結果與上述研究相反，分析原因可能是由于使用不同的標本資源和抗體有關。此外，目前絕大多數研究是基于免疫組化分析的結果，該方法本身可能影響實驗結果，且免疫組化存在一定的人為主觀性。當前針對PrPC表達與CRC預后關系的研究國內外鮮見。本研究對50例CRC患者進行隨訪，除1例失訪外，余49例獲得完整隨訪，統計分析顯示，PrPC陰性表達患者的生存時間明顯長于PrPC陽性表達患者，與Zhou等[31]和Du等[18]的研究結果相似。進一步應用Cox比例風險模型進行多因素分析，結果顯示，TNM分期及PrPC陽性表達是CRC預后的獨立影響因素，提示PrPC有望成為評估腫瘤TNM分期、分化程度及有無脈管侵犯的一種新的生物學指標，可幫助臨床醫師預測CRC的預后。鑒于PrPC在CRC組織和癌旁正常組織中的差異表達，后續可進一步針對此分子開發靶向藥物。目前已有靶向PrPC治療阿爾茲海默癥的相關研究[33]，但與PrPC相關的腫瘤靶向治療研究少見，這為后續研究提供了新的方向。

綜上所述，本研究結果表明，PrPC表達水平與CRC患者的預后密切相關，但其具體作用機制尚不清楚，未來仍需深入研究。PrPC陽性表達是影響CRC預后的獨立危險因素，但鑒于當前的研究結果存在較大差異，加之本研究樣本量較小且為單中心研究，該結果仍需后續多中心大樣本臨床研究加以驗證。