三氯乙烯致L-02細胞毒性中SET蛋白介導的組蛋白泛素化及類泛素化修飾鑒定

楊思霞，李深盼，任曉虎，陳 效，劉云崗，劉建軍

（1.南方醫科大學公共衛生學院，廣東 廣州 510515；2.深圳市疾病預防控制中心深圳市現代毒理學重點實驗室，深圳市衛生毒理學醫學重點學科，廣東 深圳 518055）

三氯乙烯（trichloroethylene，TCE）是無色易揮發有機溶劑，可通過呼吸道、消化道及皮膚接觸等途徑進入人體，流行病學調查發現，TCE暴露工人發生嚴重肝損傷［1］。嚙齒類動物長期高劑量TCE暴露，可致肝癌［2］。TCE依賴細胞色素P450（cytochrome P450，CYP）酶在肝中代謝［3］。經過CYP2E1代謝活化后，TCE及其代謝產物可引起小鼠肝全基因組DNA低甲基化及肝細胞組蛋白高乙?；淖儯?-5］。

組蛋白泛素化（ubiquitination）是一種在組蛋白上廣泛存在且與染色質變化緊密聯系的一種修飾，占總修飾中約16%［7］。泛素化蛋白被胰酶酶解后，只保留共價結合在底物蛋白賴氨酸上的2個甘氨酸，因此可通過識別泛素殘余基序抗體KGG抗體來特異性富集泛素化多肽［7］。小泛素樣修飾物（small ubiquitin-like modifer，SUMO）修飾（類泛素化修飾）有3種存在形式，也可通過特異性抗體對類泛素化修飾多肽進行富集。泛素化及類泛素化分子在激活酶（E1）、結合酶（E2）和連接酶（E3）作用下連接于底物，使自身經歷成熟、激活、結合和連接4個步驟后，最終共價結合至靶蛋白特定賴氨酸位點，使靶蛋白活性發生改變，參與調節蛋白穩定性及其他生物學功能［8］。由于結構與泛素化高度相似，類泛素化修飾位點同樣為賴氨酸［9］。因此，泛素化和類泛素化可通過競爭與蛋白質中相似賴氨酸殘基相互作用，調控部分蛋白質功能［10］。已有研究表明，泛素化和類泛素化協同在調節肝炎癥反應中起關鍵作用［10-11］。

本課題組前期研究表明，目標蛋白是TCE致肝細胞毒性的關鍵蛋白［12］，與SET蛋白相關的TCE肝毒性研究主要集中于組蛋白磷酸化、甲基化和乙酰化［13-16］，缺乏對泛素化及類泛素化修飾的研究。為全面探討TCE致肝細胞毒性中相關組蛋白修飾及與SET相關的組蛋白泛素化及類泛素，本研究以人正常肝細胞L-02及SET穩定低表達的L-02細胞（SET-siRNA細胞）為對象，采用定量蛋白質組學技術篩選TCE處理引起的相關組蛋白泛素化和類泛素化，探討TCE致肝細胞毒性中與SET蛋白相關泛素化與類泛素化，為揭示TCE致肝細胞毒作用相關表觀遺傳機制提供新線索。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器

正常人肝細胞L-02購自中國科學院上海細胞生物學研究所；SET-siRNA細胞由本課題組前期構建［17］。精氨酸殘基 C端剪切蛋白酶（clostripain，Arg-C）和碘化丙啶，美國Promega公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶和增強化學發光法顯色反應試劑盒，美國Santa Cruz公司；受試物TCE、二甲亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、Tris和二甲基標記試劑甲醛（formaldehyde，CH2O），美國Sigma公司；辣根過氧化酶，美國Bio-Rad公司；氰基硼氫化鈉、磷酸二氫鈉（NaH2PO4）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4）和Pierce C18-離心柱，美國Thermo Fisher Scientific公司。EksigentnanoLC-2D型二維納升液相色譜，美國Eksigent Technologks公司；ChromXP C18納米液相色譜柱和Waters Q-TOF質譜儀，美國Thermo公司。

1.2 細胞培養和染毒處理

L-02細胞和SET-siRNA細胞均采用含100KU·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素和含12%胎牛血清的完全RPMI 1640培養基于37℃，5%CO2細胞培養箱培養。取對數生長期細胞平鋪于六孔板中，待細胞生長至80%融合度后進行染毒。TCE溶解于DMSO，染毒溶液中DMSO的終濃度（體積百分比）為0.5%。同時設2種細胞0.5%DMSO對照組。染毒組設定劑量為1/2半數抑制濃度（half-inhibit concentration，IC50），即 8.0 mmol·L-1［18］，染毒24 h。

1.3 組蛋白的提取、分離和膠內酶切

分別收集3批2種細胞的DMSO對照組細胞及經TCE染毒處理L-02細胞和SET-siRNA細胞，用預冷PBS洗滌，重復3次。按Shechter等［19］報道方法提取、純化及分離組蛋白，每5×109細胞加1 mL低滲裂解液，混勻置冰上裂解30 min；10 000×g，4℃離心10 min，棄上清，沉淀重懸于硫酸0.2 mol·L-1后置冰上至少30 min；16 000×g，4℃離心10 min以清除核碎片，轉移上清至新1.5 mL離心管中；加入1/2體積TCE，振蕩混勻，4℃過夜；離心棄上清，用預冷丙酮洗滌沉淀，16 000×g，4℃離心10 min，用移液管小心移棄上清，室溫下風干沉淀后重溶于200 μL尿素6 mol·L-1中。利用乙酸尿素膠對組蛋白進行第1次分離；切下整個泳道置于SDS-PAGE膠上，對組蛋白進行第2次分離。分離組蛋白后切取目標蛋白點，經脫色、切碎、洗滌、干燥后置含0.2 μg Arg-C 蛋白酶的 100 mmol·L-1三乙碳酸氫銨（TEAB）溶液（pH=8.0）中，37℃酶解過夜。酶解完成后直接吸取酶解上清液即可獲得多肽樣品。

1.4 二甲基化標記

將1.3獲得多肽樣品，分別采用4%終濃度（體積百分比）CH2O，CH217O，CD2O和13CD2O在室溫下反應1 h，進行二甲基化標記，加入終濃度（體積百分比）為1%氨水終止反應，并將樣品混合?；旌蠘悠芳尤虢K濃度（體積百分比）為1%甲酸，利用Pierce C18離心柱除鹽，按照說明書操作流程對樣品進行脫鹽處理，洗脫液旋轉蒸干后用于質譜分析。

1.5 組蛋白泛素化、類泛素化鑒定和定量分析

酶解除鹽干燥后的多肽樣品溶解于10 μL緩沖溶液A（體積分數為0.1%的甲酸溶液）中，取溶解后多肽樣品2 μL進行液相色譜分析。液相色譜流動相以250 nL·min-1的流速在120 min內通過分析柱，并使開始的5%緩沖溶液B（體積分數0.1%甲酸、體積分數95%乙腈的水溶液）線性變化至95%緩沖液B。液相色譜分離后多肽樣品采用Waters Q-TOF質譜儀進行質譜分析。利用PLGS 2.5在IPI數據庫檢索所得質譜數據，分析組蛋白泛素化和類泛素化修飾圖譜，同時利用limma軟件包中的bioconductor對組蛋白泛素化和類泛素化多肽進行相對定量，并計算倍數比（multiple ratio）。倍數比=TCE組修飾水平/DMSO組修飾水平。倍數比＜1，P＜0.05，表明泛素化或類泛素化水平降低；倍數比＞1，P＜0.05，表明泛素化或類泛素化修飾水平升高。最后，根據IPI數據庫檢索報告，分析鑒定修飾水平具有統計學意義的組蛋白泛素化和類泛素化多肽序列和位點。

1.6 統計學分析

實驗數據結果用±s表示，采用SPSS20.0軟件進行統計學處理，采用單因素方差分析（one way ANOVA）方法，所有統計分析均為雙側檢驗，組間兩兩比較采用T檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 TCE對L-02細胞毒性相關組蛋白泛素化修飾譜

表1結果顯示，提取DMSO對照組和經TCE處理的L-02細胞的組蛋白，用液相色譜與質譜聯用儀分析，共鑒定出31個組蛋白泛素化修飾位點，其中10個肽段中共有15個差異組蛋白泛素化位點與TCE肝毒性有關聯（表1），有7個位點泛素化水平降低（倍數比＜1，P＜0.05），8個位點泛素化水平升高（倍數比＞1，P＜0.05）。其中1個位點（K16）位于組蛋白H2B，14個位點位于組蛋白H1。TCE致L-02肝細胞毒性相關組蛋白泛素化水平在各組蛋白上有不同改變（圖1），主要泛素化集中于組蛋白H1，占93.3%；組蛋白H2B占6.7%。

Fig.1 Modification sites and types of ubiquitination in TCE treated L-02 and SET-siRNA cells.See Tab 1 and Tab2 for the treatment.

Tab.1 Histone ubiquitination modifications （Ubi） in trichloroethylene（TCE）treated L-02 cells identified by mass spectrometry

2.2 TCE對SET-siRNA細胞毒性中SET相關組蛋白泛素化修飾譜

SET-siRNA細胞經TCE染毒處理后，共檢測出7個肽段中有10個差異組蛋白泛素化修飾位點（表2），其中組蛋白H2B的K16及組蛋白H1的K110和K186共3個位點的泛素化修飾水平在經TCE處理的L-02細胞中降低，而在SET-siRNA細胞中升高；組蛋白H1的K131，K137，K138和K148共4個修飾位點在經TCE處理的L-02細胞中升高，而在SET-siRNA細胞中降低，其余修飾位點的泛素化修飾水平在L-02細胞和SET-siRNA細胞中改變趨勢近似。TCE致SET-siRNA細胞毒性中與SET相關組蛋白泛素化修飾主要集中在組蛋白H1，占90%；組蛋白H2B占10%（圖1）。

Tab.2 Histone Ubi sites and peptide levels in TCE treated SET-siRNA hepatocytes identified by mass spectrometry

2.3 TCE對L-02細胞毒性相關組蛋白類泛素化修飾譜

質譜分析結果（表3）顯示，L-02細胞經TCE染毒處理后，共鑒定出32個組蛋白類泛素化修飾位點，其中10個肽段中有17個差異組蛋白類泛素化修飾位點與肝細胞毒性有關，14個位點類泛素化水平降低，3個位點類泛素化水平升高。圖2顯示TCE致L-02肝細胞毒性相關組蛋白類泛素化修飾水平在各組蛋白上有不同改變，與肝細胞毒性有關17個類泛素化修飾位點中，16個位點集中于組蛋白H2B，占比94.2%；1個位點位于組蛋白H4，占比5.8%。

Fig.2 Modification sites and types of SUMO in TCE treated L-02 cells and SET-siRNA cells.See Tab.3 and Tab.4 for the cell treatment.

Tab.3 Histone small ubiquitin-like modifier（SUMO）modification sites and peptide levels in TCE treated L-02 cells identified by mass spectrometry

2.4 TCE對SET-siRNA細胞毒性中SET相關組蛋白類泛素化修飾譜

表4結果顯示，SET-siRNA細胞經TCE染毒處理后，5個肽段中有9個組蛋白類泛素化修飾位點的修飾水平具有統計學差異。圖2顯示，經TCE處理后，組蛋白H2B的泛素化位點3第12修飾位點的類泛素化修飾水平在L-02細胞中升高，在SET-siRNA細胞中降低。泛素化位點1第6和12修飾位點，泛素化位點2第6修飾位點，泛素化位點3第12和13修飾位點的類泛素化修飾水平在L-02細胞中降低，而在SET-siRNA細胞中升高。其余修飾位點的類泛素化修飾水平在L-02細胞和SET-siRNA細胞中改變趨勢近似。TCE致肝細胞毒性中與SET相關組蛋白泛素化位點化修飾集中于組蛋白H2B，占100%。

3 討論

本研究利用定量蛋白質組學技術篩選TCE處理引起的相關組蛋白泛素化及類泛素化修飾，共鑒定出31個組蛋白泛素化位點，32個類泛素化位點，與TCE肝毒性相關的差異組蛋白泛素化位點15個，類泛素化位點17個。其中，TCE肝毒性受SET介導泛素化修飾位點10個，類泛素化位點9個。比較TCE染毒處理的L-02與SET-siRNA細胞發現，組蛋白H2B的K16及組蛋白H1的K110和K186泛素化修飾位點在TCE染毒處理后的SET-siRNA細胞中降低，K131，K137，K138和K148共4個泛素化位點在TCE染毒處理后的SET-siRNA細胞中升高，說明SET參與了由TCE誘發的肝細胞毒性組蛋白泛素化。組蛋白H2B K16類泛素化可促進包括GAL1在內的多種基因表達［20］。同樣，SET也參與了TCE肝細胞毒性組蛋白類泛素化。結果顯示，與L-02細胞比較，SET-siRNA細胞中組蛋白H2B K12類泛素化位點3的類泛素化水平降低；相反，SET-siRNA細胞中H2B K6類泛素化位點1和2，H2B K12類泛素化位點1和3以及H2B K13類泛素化位點3的類泛素化水平升高，表明SET蛋白可改變TCE致肝細胞毒性所引起組蛋白泛素化及類泛素化位點的變化趨勢。

本研究結果表明，組蛋白H1和組蛋白H2B發生了較多TCE肝細胞毒性泛素化和類泛素化修飾位點改變。在裂殖酵母中，H2B單泛素化依賴Rhp6/Bre1泛素連接酶復合體發生在其C端119位賴氨酸（K119）［21］。組蛋白H1具有較多濃縮染色質結構［22］，使得組蛋白H1多泛素化成為DNA雙鏈斷裂反應中重要信號中間體［23］。組蛋白分子伴侶SET可調控發生在組蛋白H1上DNA損傷［24］。同時，組蛋白H2B單泛素化蓄積了較多活躍轉錄基因［25］，當泛素化特異性蛋白酶作用于組蛋白H2B上時，組蛋白H2B泛素化修飾可調節其他組蛋白多重修飾［26］。有研究表明，組蛋白H2B泛素化可以促進組蛋白H3 K4和H3 K79位點發生甲基化［27］。我們在前期研究中已確定TCE可致組蛋白H3 K79發生甲基化［16］，提示在TCE致肝細胞毒性中組蛋白H2B泛素化可能促進H3 K79甲基化發生。

綜上所述，TCE處理L-02肝細胞可引起組蛋白泛素化修飾和類泛素化飾位點變化，且SET在其中發揮了重要作用，具體調控機制等還有待進一步研究。