梔子苷體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄過程及其肝毒性研究進(jìn)展

高 愛，張文生，3，馮成強(qiáng)

（北京師范大學(xué)1.天然藥物教育部工程研究中心，2.中藥資源保護(hù)與利用北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100875；3.地表過程與資源生態(tài)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室珠海基地，廣東 珠海 519087）

梔子是茜草科植物梔子（Gardenia jasminoodesEllis）的干燥成熟果實(shí)，具有瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒、消腫止痛等功效［1］。臨床主要用于治療糖尿病、炎癥、心煩熱病、瘡瘍腫毒和跌打損傷等。梔子是中藥復(fù)方制劑的常用藥物，《中醫(yī)方劑大辭典》共收載3523個含梔子方劑［2］。作為我國首批公布的藥食同源物，梔子也被廣泛用作膳食補(bǔ)充劑［3-5］。

梔子的主要化學(xué)成分包括環(huán)烯醚萜類（梔子苷等）、單萜類（苦藏紅花酸等）、二萜類（西紅花酸等）、三萜類（熊果酸等）、黃酮類、多糖類、揮發(fā)油和微量元素等［6］。其中梔子苷（又稱“京尼平苷”，geniposide）是梔子發(fā)揮藥效的主要成分，尤其在保肝利膽［7］、降血糖［8］、抗動脈粥樣硬化［9］、改善神經(jīng)退行性疾病［10］和抗抑郁［11］等方面作用顯著，主要通過抑制炎癥反應(yīng)、減緩氧化應(yīng)激反應(yīng)等發(fā)揮藥理作用。

但近年來有文獻(xiàn)報(bào)道梔子苷及其體內(nèi)代謝產(chǎn)物京尼平（genipin）具有肝毒性［12-14］，表明梔子的臨床應(yīng)用及梔子苷的藥物開發(fā)存在安全問題。本文對梔子苷體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄（absorption，distribution，metabolism and excretion，ADME）過程、毒性參數(shù)、肝毒性效應(yīng)及肝毒性機(jī)制等方面進(jìn)行系統(tǒng)綜述，以期為梔子的安全應(yīng)用提供參考。

1 梔子苷ADME過程

1.1 吸收和分布

王智勇等［15］發(fā)現(xiàn)，梔子苷可通過鼻腔吸入進(jìn)入體內(nèi)。張倩怡等［16］和 Yu 等［17］采用腸灌注模型發(fā)現(xiàn)，梔子苷在整段小腸內(nèi)均有吸收，其中十二指腸吸收速率最大，吸收機(jī)制除被動擴(kuò)散外，還有主動轉(zhuǎn)運(yùn)和易化擴(kuò)散。Wang等［18］通過比較ig和iv 2種給藥方式下梔子苷血漿濃度發(fā)現(xiàn)，ig給藥絕對生物利用度較低。詹宏磊等［19］通過體外透皮給藥發(fā)現(xiàn)，梔子苷可穿透皮膚，迅速分布于皮下組織和血液中，且隨時間推移滲透量不斷增高。此外，梔子苷也可通過肌內(nèi)注射［15］和尾靜脈注射［20］等方式進(jìn)入體內(nèi)。

進(jìn)入血液中的梔子苷可進(jìn)一步分布在腎、脾、肝、心、肺、腦等器官中，腎中濃度最大［20-21］。Wang等［22］ig給予大鼠梔子厚樸湯發(fā)現(xiàn)，肝中梔子苷濃度在給藥后1 h最高，且血藥濃度-時間曲線出現(xiàn)雙峰［23-24］，提示梔子苷進(jìn)入體內(nèi)后會出現(xiàn)肝腸循環(huán)增強(qiáng)現(xiàn)象。

1.2 代謝

梔子苷在體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化涉及Ⅰ相反應(yīng)和Ⅱ相反應(yīng)，其在體內(nèi)的代謝過程見圖1。梔子苷發(fā)生Ⅰ相水解反應(yīng)形成京尼平和梔子酸，同時還會發(fā)生羥基化反應(yīng)。此外，梔子苷和其苷元京尼平會與氨基、葡萄糖醛酸基、磺酸基等發(fā)生Ⅱ相結(jié)合反應(yīng)。梔子苷代謝中間體還會發(fā)生氫化、開環(huán)和分子內(nèi)脫水等反應(yīng)。

圖1 梔子苷體內(nèi)代謝過程［25-35］.M1：梔子苷；M2：京尼平；M3：梔子酸；M4：梔子苷單羥基化產(chǎn)物；M5：梔子苷甲基化產(chǎn)物；M6：梔子苷半胱氨酸結(jié)合物；M7：梔子苷葡萄糖醛酸結(jié)合物；M8：梔子苷硫酸結(jié)合產(chǎn)物；M9：梔子酸苷元；M10：京尼平-O-葡萄糖醛酸；M11：京尼平-O-葡萄糖醛酸開環(huán)衍生物；M12：京尼平-O-葡萄糖醛酸單羥基化產(chǎn)物；M13：單羥基京尼平-O-葡萄糖醛酸脫水產(chǎn)物；M14：京尼平-O-葡萄糖醛酸氫化產(chǎn)物；M15：京尼平雙醛中間體；M16：京尼平氨基加合物；M17：京尼平硫酸結(jié)合產(chǎn)物.

1.2.1 Ⅰ相反應(yīng)

研究表明，梔子苷會在ICR小鼠［25］、SD大鼠［26］和人體［27］內(nèi)被氧化發(fā)生羥化反應(yīng)。此外，梔子苷在特定條件下會發(fā)生水解反應(yīng)，首先被β-葡萄糖苷酶或腸道菌群水解成京尼平［28］，進(jìn)一步被腸道內(nèi)酯酶水解為梔子酸苷元［29］；梔子苷也會在酯酶作用下生成梔子酸［26］。Han等［30］和Yamano等［31］推測，京尼平在水解過程中發(fā)生異構(gòu)化，其半縮醛結(jié)構(gòu)變成雙醛結(jié)構(gòu)。

1.2.2 Ⅱ相反應(yīng)

梔子苷水解產(chǎn)物京尼平在磺基轉(zhuǎn)移酶作用下與硫酸結(jié)合［25-26，32-33］，形成京尼平-亞硫酸結(jié)合物。Wang等［27］發(fā)現(xiàn)，京尼平在UDP-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶的作用下與葡萄糖醛酸結(jié)合形成京尼平-葡萄糖醛酸苷，其中經(jīng)過膽汁排泄部分可被腸道中的β-葡萄糖醛酸酶水解，造成該物質(zhì)被重新吸收，京尼平-葡萄糖醛酸苷也可進(jìn)一步發(fā)生開環(huán)、羥基化、分子內(nèi)脫水和氫化等反應(yīng)。京尼平同分異構(gòu)產(chǎn)物京尼平雙醛可與氨基發(fā)生結(jié)合反應(yīng)。Kawata等［34］將25種人體腸道菌群與梔子苷在氨離子存在的厭氧環(huán)境下共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)京尼平雙醛中間體可與氨基結(jié)合。Li等［35］進(jìn)一步將京尼平與不同種類氨基酸共孵育，京尼平雙醛中間體更易與賴氨酸的ε-氨基結(jié)合。梔子苷也可直接與甲基、半胱氨酸、磺酸基、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸分別發(fā)生甲基化、氨基酸、硫酸和葡萄糖醛酸結(jié)合反應(yīng)［32-33］。

1.3 排泄

成龍等［36］分析梔子苷在大鼠體內(nèi)的排泄動力學(xué)過程發(fā)現(xiàn)，其在大鼠體內(nèi)大部分轉(zhuǎn)化為梔子藍(lán)，僅4.1%以原形形式排出體外。在大鼠尿樣中主要為京尼平的葡萄糖醛酸化及其環(huán)裂解衍生物，還有京尼平與半胱氨酸的共價結(jié)合物。而Wang等［27］發(fā)現(xiàn)，京尼平苷酸、京尼平-O-葡萄糖苷酸去甲基化衍生物和單羥基京尼平-O-葡萄糖苷酸脫水產(chǎn)物為人體尿液中特有物質(zhì)，提示大鼠與人之間存在代謝差異。

2 梔子苷毒性參數(shù)和肝毒性效應(yīng)

2.1 半數(shù)致死劑量

Ding等［12］對SD大鼠ig給予梔子苷，采用Bliss法計(jì)算梔子苷半數(shù)致死劑量（median lethal dose，LD50）為1431.1 mg·kg-1。梔子苷和梔子水提物對小鼠急性毒性很低，前者ig，ip或iv給藥LD50均為3 g·kg-1，梔子水提物ip給藥LD50為5 g·kg-1［37］。此外，用做食品色素的梔子黃被證明具有一定肝毒性，其肝毒性主要?dú)w因于其中含量高達(dá)28%的梔子苷［38］。進(jìn)一步研究表明，連續(xù)3個月ig給予SD大鼠含有2.783%梔子苷的梔子黃粉末（60 mg·kg-1·d-1梔子苷攝入量）不會引起肝毒性作用［39］。SD大鼠ig給予梔子黃（含0.234%梔子苷）的LD50為15.0 g·kg-1［40］。

2.2 觀察到有害作用最低水平及未觀察到有害作用水平

目前研究多集中在梔子苷對大鼠的未觀察到有害作用水平（no observed adverse effect level，NOAEL）值，尚無文獻(xiàn)報(bào)道梔子苷對受試動物的有害作用最低水平（lowest observed adverse effect level，LOAEL）值。楊鑒等［41］對 SD大鼠 iv給予梔子苷 28 d得到 NOAEL值為 150 mg·kg-1，Tang等［40］得出SD大鼠ig給予梔子黃90 d NOAEL值為0.5 g·kg-1。在復(fù)方制劑中，SD大鼠連續(xù)1個月ig給予梔子厚樸湯，NOAEL＜8.5 g生藥·kg-1，提示該湯同樣存在安全性風(fēng)險［42］。由于梔子苷主要通過口服進(jìn)入體內(nèi)，胃腸道代謝產(chǎn)物京尼平是造成肝毒性的主要原因，口服梔子苷的NOAEL值需進(jìn)一步研究。

3 梔子苷肝毒性效應(yīng)

體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，梔子苷及其體內(nèi)代謝產(chǎn)物京尼平具有明顯肝毒性效應(yīng)，包括影響大鼠行為表現(xiàn)、肝指數(shù)增加、肝功能指標(biāo)升高、肝細(xì)胞損害、膽汁淤積和影響肝竇狀隙等。

急性毒性試驗(yàn)表明，梔子苷ig劑量＞574 mg·kg-1可引起大鼠肝損傷［12］，且給藥后第2天毒性效應(yīng)最明顯，表現(xiàn)為體重下降、攝食減少、腹瀉、尿液糞便呈藍(lán)色、肝指數(shù)增加且顏色較深、肝功能指標(biāo)（谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、總膽紅素等）升高、甚至死亡［43-44］。李春楠等［45］采用臨床用藥范圍高臨界值（10 g梔子）ig給予大鼠90 d，在此劑量下大鼠出現(xiàn)食欲下降、脫毛等現(xiàn)象。

梔子苷肝毒性效應(yīng)多體現(xiàn)在對肝細(xì)胞的損傷，表現(xiàn)為肝細(xì)胞胞漿和核仁聚集不均勻；門靜脈周圍橢圓形細(xì)胞增生；炎癥細(xì)胞浸潤；中央靜脈周圍部分肝細(xì)胞腫脹；胞漿疏松，微染藍(lán)色；小葉內(nèi)少數(shù)肝細(xì)胞呈局灶性干酪樣壞死［46-47］；Ⅰ帶、Ⅱ帶和Ⅲ帶肝細(xì)胞均出現(xiàn)嚴(yán)重水樣變［48］。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，京尼平≥50 μmol·L-1處理肝細(xì)胞可使其發(fā)生凋亡，表現(xiàn)為線粒體膜電位明顯降低、細(xì)胞膜通透性升高；隨著京尼平處理劑量增加，還可觀察到細(xì)胞核固縮、核內(nèi)染色質(zhì)凝集、核熒光強(qiáng)度明顯升高以及細(xì)胞數(shù)量明顯下降［13，49］。

梔子苷100 mg·kg-1ig給予大鼠6個月，病理結(jié)果顯示，大鼠肝組織匯管區(qū)小葉間膽管增生，血清總膽紅素、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶顯著升高，尿液中尿膽素原和尿液膽紅素含量呈劑量相關(guān)性增加［50］。此外，梔子苷還對肝竇狀隙造成影響，出現(xiàn)肝竇狹窄甚至肝竇消失［48］。

4 梔子苷肝毒性機(jī)制

梔子苷及其體內(nèi)代謝產(chǎn)物京尼平肝損傷機(jī)制研究主要集中在發(fā)生共價結(jié)合反應(yīng)、影響代謝酶表達(dá)及活性及造成膽汁酸穩(wěn)態(tài)失衡、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和肝細(xì)胞凋亡等。

4.1 發(fā)生共價結(jié)合反應(yīng)

外源化學(xué)物經(jīng)過體內(nèi)代謝過程，形成的終產(chǎn)物會與體內(nèi)靶分子發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)一步激活下游信號通路，引起毒性效應(yīng)，梔子苷體內(nèi)代謝產(chǎn)物京尼平誘導(dǎo)的共價結(jié)合反應(yīng)是其毒性機(jī)制之一。京尼平具有半縮醛結(jié)構(gòu)，可進(jìn)一步代謝為京尼平雙醛化合物，該醛類物質(zhì)作為親電子劑可與氨基等親核基團(tuán)發(fā)生共價結(jié)合反應(yīng)［34-35］。京尼平的C1位羥基是其產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)的活性基團(tuán)。Che等［51］對京尼平C1位羥基進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造形成甲基京尼平，ig給予大鼠等量甲基京尼平和梔子苷發(fā)現(xiàn)，甲基京尼平不造成肝毒性效應(yīng)，原因是甲基京尼平更穩(wěn)定，不易脫甲基暴露出京尼平C1位羥基。大鼠ig給予梔子苷后發(fā)現(xiàn)，腸、肝、糞便均出現(xiàn)不同程度藍(lán)色物質(zhì)，為梔子苷經(jīng)過β-葡萄糖苷酶水解成京尼平并與腸、肝內(nèi)氨基酸結(jié)合形成的梔子藍(lán)［52］。曾推測梔子藍(lán)為梔子苷造成肝毒性最終物質(zhì)基礎(chǔ)［53］，但衛(wèi)璐戈等［14］通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，梔子藍(lán)肝毒性效應(yīng)并不明顯，它僅僅是梔子苷經(jīng)過Ⅱ相解毒途徑形成的Ⅱ相代謝物。生物大分子（如蛋白質(zhì)和不飽和脂質(zhì)等）往往帶有氨基活性位點(diǎn)，京尼平雙醛是否與其發(fā)生共價結(jié)合從而導(dǎo)致肝損傷有待深入研究。

4.2 影響代謝酶的表達(dá)和活性

細(xì)胞色素P450（CYP450）酶系包含多種亞型，梔子苷對CYP亞型有選擇性作用。Kang等［54］連續(xù)4 d ig給予大鼠京尼平0.1 g·kg-1和梔子提取物2 g·kg-1，肝微粒體中CYP3A1/2表達(dá)量降低，但對CYP1A1和CYP2E1無影響。進(jìn)一步對肝微粒體CYP3A2研究發(fā)現(xiàn)，在梔子苷低劑量（62.5 mg·kg-1）和中劑量（125 mg·kg-1）組中CYP3A2酶活性較高，而高劑量（250 mg·kg-1）組酶活性明顯下降［55］，提示高劑量（250 mg·kg-1）組可通過抑制CYP3A2活性呈現(xiàn)毒性效應(yīng)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，京尼平顯著影響HepG2細(xì)胞CYP2D6，CYP2C19和CYP3A4表達(dá)，其中對CYP2D6表達(dá)及活性有明顯促進(jìn)作用，而對CYP2C19和CYP3A4的表達(dá)及活性有明顯抑制作用［56］。

4.3 造成膽汁酸穩(wěn)態(tài)失衡

Tian等［57］研究表明，ig給予大鼠梔子苷300 mg·kg-1可顯著升高膽汁酸生物合成限速酶CYP7A1mRNA表達(dá)，下調(diào)膽酸鹽輸出泵（bile salt export pump，BSEP）、法尼醇X受體（farnesoid X receptor，F(xiàn)XR）和蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatase，PTP）mRNA表達(dá)，阻礙膽汁酸排泄。當(dāng)以低劑量（100 mg·kg-1）梔子苷ig給予大鼠時發(fā)現(xiàn)，肝中CYP7A1的mRNA和蛋白表達(dá)降低，BSEP和FXR的mRNA和蛋白表達(dá)升高，促進(jìn)膽汁排出，發(fā)揮利膽功效［58］。可見梔子苷在不同劑量時可啟動不同分子機(jī)制，高劑量（300 mg·kg-1）以阻礙膽汁排出為主，低劑量（100 mg·kg-1）以促進(jìn)膽汁排出為主。此外，不同劑量膽汁酸譜含量變化也是造成肝損傷的關(guān)鍵，田婧卓［59］和劉毓等［60］實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高劑量（＞300 mg·kg-1）ig給予梔子苷可使大鼠肝組織中牛磺膽酸和牛磺鵝去氧膽酸水平顯著升高；梔子苷誘導(dǎo)的肝毒性可通過膽汁酸中牛磺膽酸和牛磺鵝去氧膽酸水平來反映。

4.4 誘導(dǎo)氧化應(yīng)激

過量活性氧（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生會使體內(nèi)原有氧化還原平衡被破壞，導(dǎo)致組織和細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激。氧化損傷時，過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）水平降低，乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平升高。動物實(shí)驗(yàn)研究表明，ig給予大鼠過量梔子［61］或梔子苷［12］可造成大鼠肝組織中SOD和GSH活性顯著降低，MDA含量顯著升高，但并不造成小鼠肝組織相應(yīng)指標(biāo)發(fā)生改變［62］，梔子苷因氧化應(yīng)激引起肝損傷可能與動物品系相關(guān)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，京尼平可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生過氧化損傷，LDH含量顯著升高［63］，SOD，CAT和GSH活性顯著降低［13］。Kim等［49］研究進(jìn)一步表明，京尼平通過還原型輔酶Ⅱ氧化酶介導(dǎo)過量ROS產(chǎn)生。

4.5 誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)

NF-κB是引發(fā)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)其被激活后可誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子腫瘤壞死因子α（tumour necrosis factor-α，TNF-α），白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-6等基因表達(dá)［64］。梔子苷可通過促使TNF-α過表達(dá)，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。王坤等［61］發(fā)現(xiàn)，過量梔子苷使大鼠肝組織TNF-α表達(dá)上調(diào)。李春楠［45］進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，梔子苷進(jìn)入機(jī)體后可通過激活TNF受體1，進(jìn)一步激活NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶信號通路，促進(jìn)TNF-α釋放，造成肝細(xì)胞炎性損傷。

4.6 啟動肝細(xì)胞凋亡途徑

王坤等［61］發(fā)現(xiàn)，ig給予大鼠10倍臨床劑量梔子水煎液，造成肝組織Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低，Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)比值顯著升高，誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡。Khanal等［63］進(jìn)一步研究表明，京尼平可通過激活ROS/c-Jun N端激酶通路上調(diào)Bax/Bcl-2比值，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞色素c從線粒體釋放進(jìn)入胞漿可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。任艷青等［13，65］發(fā)現(xiàn)，京尼平50～1000 μmol·L-1均可不同程度降低線粒體膜電位，促進(jìn)細(xì)胞色素c釋放。細(xì)胞色素c進(jìn)入胞漿進(jìn)一步激活胱天蛋白酶家族成員發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)，引起細(xì)胞凋亡［49］。

5 結(jié)語

對梔子苷肝毒性認(rèn)識的不斷深入表明加強(qiáng)對其安全性評價十分必要。①梔子中梔子苷含量范圍差異較大，梔子苷安全限量有待進(jìn)一步研究；②梔子苷大鼠肝毒性效應(yīng)高于小鼠，種屬差異機(jī)制有待深入研究；③京尼平是具有半縮醛結(jié)構(gòu)化合物，在體內(nèi)進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成帶雙醛結(jié)構(gòu)物質(zhì)，該物質(zhì)是否為造成肝毒性效應(yīng)終毒物及其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。正確認(rèn)識梔子肝毒性對梔子的安全使用具有重要意義。