重組牛乳鐵蛋白多肽對(duì)沙門菌抑菌作用機(jī)制研究

李海濤 ， 張 宇 ， 劉艷環(huán) ， 桑 銳 ， 葛冰潔 ， 周鴻緣 ， 王 巍 ， 苗利光 ， 張雪梅

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院 ， 吉林 延吉 133002 ； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所 ， 吉林 長春 130112)

牛乳鐵蛋白(Bovine lactoferrin，bLf)是一種鐵結(jié)合糖蛋白，分子量約為80 kDa，在牛乳汁中廣泛存在，尤其在牛初乳中含量較高，具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、殺菌和抗腫瘤等生物活性功能[1-3]。牛乳鐵蛋白廣泛應(yīng)用于調(diào)制乳、風(fēng)味發(fā)酵乳和含乳飲料中，并且作為營養(yǎng)強(qiáng)化劑用于嬰幼兒配方奶粉及食品中[4-5]。

牛乳鐵蛋白的重要生物學(xué)作用之一是抗菌，其具有抑菌譜廣、天然、無毒等抗菌特點(diǎn)，近年來被研究者廣泛關(guān)注。重組牛乳鐵蛋白多肽(Recombinant bovine lactoferrin polypeptide，rbLfP)是從牛乳鐵蛋白分子的N-末端分離到的1條多肽[6]，是經(jīng)基因改造后由畢赤酵母真核表達(dá)載體分泌表達(dá)的一種重造蛋白質(zhì)，具有高效廣譜的抗菌活性，對(duì)動(dòng)物臨床常見雞白痢沙門菌[7]、綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌[8]等病原菌均有很好的抑菌活性，未來將會(huì)在養(yǎng)殖替抗應(yīng)用領(lǐng)域有突破性研究進(jìn)展。

目前，對(duì)rbLfP的研究主要集中在理化性質(zhì)[9]、發(fā)酵工藝[10]、質(zhì)量鑒定[9]等方面，對(duì)其抗菌機(jī)制的研究相對(duì)較少。本試驗(yàn)從rbLfP對(duì)沙門菌的體外最小抑菌濃度(Minimal inhibitory concentration,MIC)、細(xì)胞膜損傷作用和對(duì)細(xì)菌基因組DNA的相互作用影響等方面研究rbLfP對(duì)沙門菌抑菌的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 rbLfP溶液(2 000 μg/mL)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所獸用生物藥創(chuàng)制技術(shù)中試平臺(tái)提供；Mueller-Hinton(MH)肉湯培養(yǎng)基、瓊脂粉，均購自北京索萊寶科技有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；PURExpressTM體外蛋白合成試劑盒，購自紐英倫生物技術(shù)(北京)有限公司。

1.2 主要儀器 MultiskanSkyHigh全波長酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技(中國)有限公司產(chǎn)品；Bio-RadSynergy H1光譜儀，伯樂(上海)生命科學(xué)研究發(fā)展有限公司產(chǎn)品；THZ-98A恒溫振蕩培養(yǎng)箱、BPH-9402精密恒溫培養(yǎng)，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 菌株 沙門菌選用雞白痢沙門菌(CVCC1790)，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所保存。

1.4 rbLfP對(duì)沙門菌體外最小抑菌濃度(MIC)測定 取rbLfP溶液，使用無菌水進(jìn)行倍比稀釋至濃度分別為128、64、32、16 μg/mL和8 μg/mL，備用。體外MIC的測定方法參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)標(biāo)準(zhǔn)，具體步驟：挑取過夜培養(yǎng)的MH肉湯瓊脂平板上的沙門菌單菌落，接種于MH肉湯液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)16 h，調(diào)整菌液濃度為1.0×106CFU/mL，作為菌懸液備用；向無菌96孔培養(yǎng)板中各加入180 μL菌懸液，每行設(shè)置樣品孔和陰性對(duì)照孔，樣品孔分別加入濃度為128、64、32、16 μg/mL和8 μg/mL的rbLfP稀釋液20 μL，設(shè)置3個(gè)平行，同時(shí)設(shè)置3個(gè)菌懸液空白對(duì)照孔[11-12]，陰性對(duì)照孔內(nèi)加入20 μL無菌水。37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)16 h，每隔2 h采樣1次，測定OD600 nm值，無細(xì)菌生長的最低rbLfP濃度即為MIC。

1.5 rbLfP對(duì)沙門菌細(xì)胞膜的損傷作用

1.5.1 rbLfP作用沙門菌后胞外核酸和蛋白質(zhì)濃度的變化 取對(duì)數(shù)生長期的沙門菌菌液，用MH肉湯液體培養(yǎng)基稀釋至1.0×106CFU/mL，分別加入rbLfP至終濃度為1×MIC(1×MIC組)、2×MIC(2×MIC組)，空白對(duì)照組(CK)加入等量的無菌水，混勻，于37 ℃保溫孵育，于0、2 h和4 h取樣，10 000 r/min離心10 min，取上清液于260 nm、280 nm測定其吸光度值，分析細(xì)菌胞外核酸和蛋白質(zhì)濃度變化規(guī)律[13-14]。

1.5.2 rbLfP作用沙門菌后基因組DNA濃度的變化 取對(duì)數(shù)生長期的沙門菌菌液，用MH肉湯液體培養(yǎng)基稀釋至1.0×106CFU/mL，加入rbLfP至終濃度為1×MIC(1×MIC組)、2×MIC(2×MIC組)，設(shè)置空白對(duì)照組(CK)，加入等量的無菌水，混勻，于37 ℃保溫孵育16 h，然后使用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取細(xì)菌基因組，于260 nm測定其吸光度值，分析基因組DNA濃度變化規(guī)律。

1.5.3 rbLfP對(duì)沙門菌細(xì)胞膜滲透性的影響 通過測定細(xì)胞膜電導(dǎo)率來檢測rbLfP對(duì)沙門菌細(xì)胞膜滲透性的影響，按照參考文獻(xiàn)[15]的方法進(jìn)行。取在對(duì)數(shù)生長期的沙門菌，OD600 nm為0.8～1.0，使用PBS溶液清洗3次，并用PBS溶液重懸菌體使之混勻，加入rbLfP并使其終濃度為1×MIC(1×MIC組)，將處理的沙門菌懸液在37 ℃、160 r/min條件下孵育培養(yǎng)。每隔2 h取樣1次，3 000 r/min離心15 min，取上清液測定電導(dǎo)率值；然后加熱煮沸處理20 min，3 000 r/min離心15 min，取上清液測定電導(dǎo)率值。設(shè)置空白對(duì)照組(CK)，使用等體積去離子水代替rbLfP。

按照公式(1)，用電導(dǎo)率值計(jì)算相對(duì)滲透率，使用相對(duì)滲透率表示細(xì)胞膜的滲透性。

K/%=(J1-J0)/(J2-J0)×100%

(1)

其中：K為采用時(shí)間的相對(duì)滲透率(%)，J0為起始時(shí)間的電導(dǎo)率(ms/cm)，J1為采樣時(shí)間的電導(dǎo)率(ms/cm)，J2為采樣時(shí)間煮沸處理后的電導(dǎo)率(ms/cm)。

1.6 rbLfP對(duì)基因組DNA的相互作用影響

1.6.1 rbLfP對(duì)體外蛋白質(zhì)合成的抑制作用 按照PURExpressTM體外蛋白合成試劑盒說明書，加入rbLfP終濃度分別為1×MIC、2×MIC、4×MIC、8×MIC和16×MIC，設(shè)置空白對(duì)照組(CK)和陽性對(duì)照組，不加S70、rbLfP的為空白對(duì)照組，不加rbLfP的為陽性對(duì)照組。反應(yīng)結(jié)束后，使用酶標(biāo)儀于280 nm測定其吸光度值[16]。

按照公式(2)計(jì)算蛋白合成速率，反應(yīng)rbLfP對(duì)蛋白質(zhì)合成的抑制作用。

ps/%=Δb/Δa×100%

(2)

其中：ps為相對(duì)蛋白質(zhì)合成速率(%)，Δb為rbLfP處理組吸光值曲線的斜率，Δa為陽性對(duì)照組吸光值曲線的斜率。

1.6.2 DNA凝膠阻滯試驗(yàn) 將生長至對(duì)數(shù)期的沙門菌10 000 r/min離心10 min，然后用PBS清洗3次，再用PBS重懸菌體，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒操作說明書進(jìn)行DNA提取，使用紫外分光光度計(jì)測定OD260 nm，并用1×TE溶液稀釋提取的DNA，使其濃度在OD260 nm為1.8左右[17]。取10 μL細(xì)菌基因組DNA分別與1×MIC、2×MIC的rbLfP等體積混合，設(shè)置生理鹽水空白對(duì)照組(CK)，37 ℃靜止培養(yǎng)30 min。反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察rbLfP與DNA相互作用后的凝膠阻滯結(jié)果。

1.6.3 熒光光譜分析rbLfP與DNA相互作用方式 參照參考文獻(xiàn)[18-19]方法，在96孔板中加入濃度為50 μg/mL的沙門菌基因組DNA和100 μg/mL的EB溶液10 μL，然后分別加入1×MIC、2×MIC的rbLfP混勻，設(shè)置生理鹽水空白對(duì)照組(CK)，混合均勻后置于培養(yǎng)箱中37 ℃避光反應(yīng)30 min。結(jié)束后，用Bio-Rad Synergy H1光譜儀在波長550～750 nm進(jìn)行光譜分析。

1.7 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2019進(jìn)行整理，采用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 rbLfP對(duì)沙門菌體外MIC測定 將rbLfP濃度從128 μg/mL倍比稀釋至8 μg/mL后作用于沙門菌，37 ℃培養(yǎng)16 h，每隔2 h采樣1次并測定OD600 nm值。結(jié)果如圖1所示，rbLfP質(zhì)量濃度與OD600 nm值呈線性反比關(guān)系，隨著rbLfP質(zhì)量濃度變大，OD600 nm值變小，說明rbLfP質(zhì)量濃度越大對(duì)沙門菌的抑制作用越強(qiáng)。與空白對(duì)照孔(0 μg/mL)相比，樣品孔均對(duì)沙門菌生長產(chǎn)生了抑制作用，當(dāng)rbLfP濃度為32 μg/mL時(shí)，rbLfP基本抑制了沙門菌的生長；當(dāng)rbLfP濃度在32 μg/mL以上時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間從4 h后，OD600 nm值越來越小，細(xì)菌繁殖受到了明顯的抑制。因此，rbLfP對(duì)沙門菌體外MIC為32 μg/mL。

圖1 rbLfP對(duì)沙門菌體外最小抑菌濃度的測定Fig.1 MIC of rbLfP against Salmonella in vitro

2.2 rbLfP對(duì)沙門菌細(xì)胞膜的損傷作用

2.2.1 rbLfP作用沙門菌后胞外核酸和蛋白質(zhì)濃度的變化 結(jié)果如圖2、圖3所示，在1×MIC、2×MIC的rbLfP作用下培養(yǎng)2 h，培養(yǎng)液中的核酸和蛋白質(zhì)含量升高，與空白對(duì)照比較差異顯著(P<0.05)；rbLfP作用4 h，相比培養(yǎng)2 h培養(yǎng)液中的核酸和蛋白質(zhì)含量均有所升高，與空白對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05)。可見rbLfP作用于沙門菌導(dǎo)致細(xì)菌培養(yǎng)液在260 nm和280 nm吸光度有明顯變化，說明細(xì)胞膜的通透性變大，細(xì)胞膜完整性受損；同時(shí)，可以觀察到胞內(nèi)大分子物質(zhì)核酸和蛋白質(zhì)透膜泄漏變化與rbLfP的濃度和作用時(shí)間呈線性正相關(guān)。結(jié)果表明，rbLfP可以改變沙門菌細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)外漏，從而抑制菌體正常生長和繁殖。

圖2 rbLfP作用沙門菌后胞外核酸濃度的變化Fig.2 Concentration changes of extracellular nucleic acid of Salmonella treated with rbLfP與空白對(duì)照組比較，a：P<0.05；下圖同Compared with CK group,a：P<0.05. The same as below

圖3 rbLfP作用沙門菌后胞外蛋白質(zhì)濃度的變化Fig.3 Concentration changes of extracellular protein of Salmonella treated with rbLfP

2.2.2 rbLfP作用沙門菌后基因組DNA濃度的變化 結(jié)果如圖4所示，rbLfP與沙門菌共培養(yǎng)2 h，1×MIC組細(xì)菌基因組DNA濃度比空白對(duì)照組低，但差異不顯著(P>0.05)，2×MIC組細(xì)菌基因組DNA的濃度明顯較空白對(duì)照組低，且結(jié)果差異顯著(P<0.05)；在共培養(yǎng)4 h時(shí)，空白對(duì)照組的細(xì)菌基因組DNA濃度明顯升高，1×MIC組和2×MIC組的細(xì)菌基因組DNA濃度明顯降低，與空白對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05)。隨著rbLfP濃度的升高和作用時(shí)間的延長，細(xì)菌基因組DNA濃度逐漸減少，表明rbLfP對(duì)沙門菌的抑殺過程中，細(xì)菌基因組DNA的外泄與rbLfP的濃度和作用時(shí)間呈正相關(guān)。結(jié)果表明，rbLfP在一定濃度時(shí)可以有效抑制細(xì)菌基因組DNA的復(fù)制，從而起到抑菌、殺菌作用。

圖4 rbLfP對(duì)沙門菌基因組DNA的影響Fig.4 Effects of rbLfP on genomic DNA of Salmonella

2.2.3 rbLfP對(duì)沙門菌細(xì)胞膜滲透性的影響 通過檢測電導(dǎo)率，利用相對(duì)滲透率來表示細(xì)菌細(xì)胞膜損傷后通透性的改變。如圖5所示，1×MIC的rbLfP與沙門菌共培養(yǎng)后，隨著時(shí)間變化，相對(duì)滲透率變大，在4 h之后，1×MIC組的相對(duì)滲透率與空白對(duì)照組比較，差異顯著(P<0.05)；到6 h后變化趨緩基本穩(wěn)定。說明rbLfP可以改變沙門菌細(xì)胞膜的通透性，與通透性相關(guān)的金屬離子從胞內(nèi)向胞外滲出，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)環(huán)境改變；rbLfP對(duì)沙門菌的作用方式之一是通過改變細(xì)胞膜的通透性，進(jìn)而可能影響胞內(nèi)外物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝等功能，從而起到抑制沙門菌生長的作用。

圖5 rbLfP對(duì)細(xì)胞膜相對(duì)滲透率的影響Fig.5 Effects of rbLfP on relative permeability of cell membrane

2.3 rbLfP對(duì)基因組DNA的相互作用影響

2.3.1 rbLfP對(duì)蛋白質(zhì)合成的抑制作用 為研究rbLfP對(duì)細(xì)胞胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的抑制作用，選用體外無細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)，進(jìn)行蛋白質(zhì)合成抑制試驗(yàn)。結(jié)果見圖6，rbLfP對(duì)蛋白質(zhì)合成抑制作用呈現(xiàn)一定的劑量依賴效應(yīng)，較低濃度的rbLfP對(duì)蛋白質(zhì)合成抑制作用不明顯，8×MIC的rbLfP對(duì)蛋白質(zhì)合成速率為79%，抑制率為21%，16×MIC的rbLfP蛋白質(zhì)合成速率為54%，抑制率為46%，對(duì)蛋白質(zhì)合成抑制速率效果更明顯。因此，rbLfP可以通過影響細(xì)菌胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成來抑殺細(xì)菌，且抑殺效果與rbLfP的濃度呈正相關(guān)。

圖6 rbLfP對(duì)體外蛋白質(zhì)合成的影響Fig.6 Effects of rbLfP on protein synthesis in vitro

2.3.2 rbLfP對(duì)細(xì)菌基因組DNA凝膠阻滯試驗(yàn) 結(jié)果如圖7所示，在凝膠電泳時(shí)，rbLfP與DNA的結(jié)合物在瓊脂糖凝膠上的遷移速率比DNA慢；rbLfP可以與EB競爭性結(jié)合細(xì)菌基因組DNA，隨著rbLfP濃度增加，DNA的遷移速率越慢，但沒有達(dá)到完全阻斷DNA遷移的水平。由此可見，rbLfP可能通過改變細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性進(jìn)入細(xì)菌菌體后與胞內(nèi)DNA的作用靶點(diǎn)發(fā)生作用，影響細(xì)菌基因組DNA的復(fù)制，由于rbLfP在2×MIC的濃度下，未能完全阻斷DNA的遷移，因此rbLfP與DNA直接結(jié)合的能力有限，所以，此途徑不一定是主要抑菌途徑。

圖7 rbLfP與細(xì)菌基因組DNA結(jié)合的凝膠阻滯試驗(yàn)Fig.7 Gel retardation analysis of rbLfP binding to bacterial genomic DNA

2.3.3 熒光光譜分析rbLfP與DNA的作用影響 結(jié)果如圖8所示，濃度在1×MIC、2×MIC時(shí)，rbLfP與基因組DNA的結(jié)合能力比較有限，在550～750 nm的紫外吸收光譜發(fā)生變化，600 nm和650 nm的吸收峰發(fā)生位移，高度降低，但影響作用有限，結(jié)果差異不顯著(P>0.05)。結(jié)果表明，可能是rbLfP分子中的氨基酸與細(xì)菌基因組DNA的磷酸骨架結(jié)合，抑或是與DNA分子發(fā)生溝槽作用，影響細(xì)菌基因組DNA的復(fù)制。

圖8 rbLfP與DNA相互作用的熒光光譜分析Fig.8 Fluorescence spectrum analysis of rbLfP interaction with DNA

3 討論

牛乳鐵蛋白的抗菌功能是其主要生物學(xué)功能之一，也是較早被發(fā)現(xiàn)的生物學(xué)功能，對(duì)常見的病原細(xì)菌諸如大腸桿菌、沙門菌[20]、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、結(jié)核分枝桿菌等均有良好的抑菌效果[21-22]。Evelien等在研究牛乳鐵蛋白對(duì)溶血性大腸桿菌的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，通過直腸給藥能夠?qū)Τ鲅源竽c桿菌O157∶H7在牛體內(nèi)的感染進(jìn)行有效的治療，同時(shí)可以調(diào)節(jié)牛的機(jī)體免疫力[23]。周恬等研究表明，口服牛乳鐵蛋白能抑制牙齦卟啉單胞菌的生長繁殖，對(duì)牙周組織炎癥有很好的控制作用[24]。

牛乳鐵蛋白的抗菌機(jī)制如何，是通過何種途徑進(jìn)行抑制細(xì)菌繁殖生長的呢？目前對(duì)牛乳鐵蛋白抑菌機(jī)制的研究較少，而與之同源性最相近的乳鐵蛋白抑菌機(jī)制則研究較多。有研究表明，乳鐵蛋白的抑菌機(jī)制與其特殊的分子結(jié)構(gòu)有關(guān)系。乳鐵蛋白表面某些結(jié)構(gòu)能夠與細(xì)菌表面分子非特異性結(jié)合，對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜上的通道位點(diǎn)能夠有效的封閉，進(jìn)而通過封閉通道位點(diǎn)來阻斷營養(yǎng)物質(zhì)和菌體內(nèi)合成蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而抑制細(xì)菌的合成與代謝[25]。乳鐵蛋白的分子結(jié)構(gòu)中含有氨基末端強(qiáng)陽離子結(jié)合區(qū)域，使得其帶正電荷，可通過其與革蘭陰性菌表面的脂多糖(陽離子區(qū))相互作用，與帶負(fù)電荷的細(xì)胞表面成分有很強(qiáng)的親和性，可黏附于細(xì)菌的細(xì)胞膜，從而增強(qiáng)細(xì)胞膜的通透性，使細(xì)菌的脂多糖從外膜滲出，導(dǎo)致菌體內(nèi)部的核酸和蛋白質(zhì)泄漏，起到裂解細(xì)菌、抑制細(xì)菌生長繁殖的作用[26-27]。

核酸和蛋白質(zhì)是細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)兩類重要的大分子物質(zhì)，在正常生理狀態(tài)條件下，不能穿透細(xì)胞膜，但當(dāng)藥物或者其他刺激源對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜完整性造成破壞時(shí)，核酸和蛋白質(zhì)會(huì)通過細(xì)胞膜上特定孔道釋放到細(xì)胞外，利用核酸在260 nm、蛋白質(zhì)在280 nm處有較強(qiáng)的紫外吸收，可以通過檢測培養(yǎng)液中核酸和蛋白質(zhì)紫外吸收強(qiáng)度的變化規(guī)律來判斷細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性[28-29]。

本試驗(yàn)對(duì)rbLfP抑制沙門菌生長繁殖的機(jī)制進(jìn)行了探索，結(jié)果顯示，rbLfP對(duì)沙門菌的體外MIC為32 μg/mL時(shí)，可以有效抑制菌體生長繁殖。對(duì)rbLfP抑菌機(jī)制的進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，在1×MIC、2×MIC的rbLfP作用下培養(yǎng)2 h，沙門菌培養(yǎng)液中的核酸和蛋白質(zhì)含量均升高，結(jié)果與空白對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，rbLfP與細(xì)菌共培養(yǎng)4 h，培養(yǎng)液中的核酸和蛋白質(zhì)含量明顯升高，與空白對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。通過對(duì)細(xì)胞膜滲透率的變化研究表明，rbLfP可以通過改變沙門菌細(xì)胞膜表面的通透性，使細(xì)胞膜相對(duì)滲透率變大，對(duì)菌體細(xì)胞膜的完整性造成損傷，導(dǎo)致菌體內(nèi)金屬離子、核酸和蛋白質(zhì)泄漏，起到抑菌作用，且rbLfP濃度越高，抑菌作用效果越明顯。

研究表明，EB是一種非常典型的靈敏度高、選擇性好的嵌入式熒光探針，其本身的熒光很弱。EB與DNA作用，EB的生色基團(tuán)插入DNA堿基序列中，插入形式是以較高親和力嵌入DNA的雙鏈內(nèi)部的堿基對(duì)之間，EB與DNA結(jié)合后熒光強(qiáng)度將會(huì)大幅度增強(qiáng)[30]。rbLfP與EB共存于DNA體系時(shí)，rbLfP與EB則相互競爭與DNA的結(jié)合，導(dǎo)致EB與DNA結(jié)合的能力變?nèi)酰跓晒夤庾V檢測時(shí)，表現(xiàn)為熒光光譜強(qiáng)度降低。蛋白質(zhì)可以與DNA的雙螺旋表面通過靜電作用的方式相結(jié)合，同時(shí)可以與顯色液EB競爭性結(jié)合DNA，在凝膠電泳時(shí)蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合的復(fù)合物比EB與DNA結(jié)合產(chǎn)物的遷移速率慢，發(fā)生拖尾等現(xiàn)象[31]。體外蛋白質(zhì)合成速率試驗(yàn)驗(yàn)證了rbLfP在體外有一定的抑制蛋白質(zhì)合成的效果。本試驗(yàn)中熒光光譜分析rbLfP與DNA磷酸骨架的影響結(jié)果顯示，rbLfP使沙門菌DNA的吸收峰發(fā)生位移，高度降低，但影響作用有限，結(jié)果差異不顯著(P>0.05)，可能是rbLfP分子中的氨基酸與細(xì)菌基因組DNA的磷酸骨架結(jié)合，抑或是與DNA分子發(fā)生溝槽作用，影響細(xì)菌基因組DNA的復(fù)制，抑制沙門菌的生長繁殖，起到抑菌殺菌效果。

本試驗(yàn)揭示了rbLfP對(duì)沙門菌抑菌的作用機(jī)制：rbLfP可通過改變沙門菌細(xì)胞膜的通透性，可能是rbLfP對(duì)沙門菌抑菌的主要作用途徑；同時(shí)其與細(xì)胞內(nèi)DNA相互作用，抑制菌體DNA復(fù)制，起到一定抑菌作用，可以與膜損傷抑菌途徑共同作用，但不是主要抑菌作用途徑。本試驗(yàn)結(jié)果為下一步研究rbLfP抑菌的分子機(jī)理提供了科學(xué)依據(jù)。