諾如病毒和輪狀病毒三重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法的建立

安 微 ， 鄭 晶 ， 車穎欣 ， 陳世界 ， 張 婧 ， 楊 苗 ， 謝 禮 ， 林 華

(1.成都海關(guān)技術(shù)中心 ， 四川 成都 610041 ； 2. 食品安全檢測(cè)四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ， 四川 成都 610041)

由病毒污染食物所引起的食源性病毒疾病成為目前愈發(fā)受到關(guān)注的問(wèn)題。據(jù)有關(guān)報(bào)道顯示，在世界范圍內(nèi)，有超過(guò)50%的食源性病毒疾病在臨床上表現(xiàn)為非細(xì)菌性急性胃腸炎癥狀。非細(xì)菌性急性胃腸炎可以由多種病原體引起，已經(jīng)證實(shí)的病原體有諾如病毒(Norovirus，NV)、輪狀病毒(Rotavirus，RV)、星狀病毒(Astrovirus，AstV)、札如病毒(Sapovirus，SaV)和腸道腺病毒(Adenovirus，AdV)[1]。其中，大于90%的非細(xì)菌性急性胃腸炎是由NV和RV所造成的[2]。近年來(lái)，我國(guó)因NV引起的非細(xì)菌性胃腸炎的報(bào)道呈現(xiàn)逐年增多的趨勢(shì)，國(guó)內(nèi)開(kāi)展的流行病學(xué)研究顯示，在我國(guó)成人感染NV的比例高達(dá)90%，可謂形勢(shì)不容樂(lè)觀[3]。RV是引起5歲以下嬰幼兒非細(xì)菌性胃腸炎的最常見(jiàn)的病原體，盡管目前針對(duì)RV已經(jīng)有了相應(yīng)的疫苗，但是每年在全世界范圍內(nèi)仍然有超過(guò)數(shù)百萬(wàn)人因?yàn)槭秤帽籖V污染的食物和水而導(dǎo)致住院，死亡病例達(dá)到20萬(wàn)之多[4]。

隨著NV和RV引起的食品污染問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重，加強(qiáng)檢測(cè)是預(yù)防疾病的一種有效方法。目前，針對(duì)NV和RV的檢測(cè)多以單一熒光定量PCR為主，三重?zé)晒舛縋CR同時(shí)檢測(cè)這3種病毒的報(bào)道較少。因此，本試驗(yàn)開(kāi)展了三重?zé)晒舛縋CR同時(shí)檢測(cè)GⅠ型諾如病毒(Genogroup I Norovirus,GI-NV)、GII型諾如病毒(Genogroup II Norovirus,GII-NV)和A群輪狀病毒(Group A Rotaviruses,A-RV)的方法學(xué)研究，旨在建立同時(shí)、快速、準(zhǔn)確檢測(cè)這3種流行性較廣的病原體，給檢測(cè)和預(yù)防NV和RV提供更多的技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 陽(yáng)性模板與毒株 根據(jù)GI-NV、GII-NV的開(kāi)放閱讀框1(Open reading frame 1,Orf1)和開(kāi)放閱讀框2(Open reading frame 2,Orf2)之間的保守基因序列、A-RV的非結(jié)構(gòu)蛋白3(Non-structural protein 3,Nsp3)的保守基因序列作為檢測(cè)擴(kuò)增的靶標(biāo)。人工合成GI-NVOrf1和Orf2基因之間的序列，片段大小為290 bp (GenBank登錄號(hào)：M87661；合成區(qū)間：5 191～5 480 bp)；人工合成GII-NVOrf1和Orf2基因之間的序列，片段大小為280 bp (GenBank登錄號(hào)：X86557；合成區(qū)間：4 921～5 200 bp)；人工合成A-RVNsp3基因序列，片段大小為270 bp(GenBank登錄號(hào)：EU868888；合成區(qū)間：4 921～5 190 bp)。人工合成的基因片段連接到PMV質(zhì)粒上，構(gòu)建陽(yáng)性質(zhì)粒。基因由北京六合華大基因科技有限公司合成。用于特異性試驗(yàn)檢測(cè)的AstV、腸道AdV、SaV等引起非細(xì)菌性胃腸炎的常見(jiàn)病原體的陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為本實(shí)驗(yàn)室保存。

動(dòng)物源食品樣本包括牛肉36份、豬肉18份、雞肉20份、海鮮35份(其中蝦15份、牡蠣20份)，共計(jì)109份，為2019年5—12月送檢的動(dòng)物源食品樣本，樣本按照常規(guī)方法處理后分裝編號(hào)，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑 普通PCR試劑盒、DNA片段膠回收試劑盒、熒光定量試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒，均購(gòu)自上海近岸科技有限公司；GI-NV、GII-NV和A-RV核酸檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)自江蘇碩世生物科技股份有限公司；RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒，均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.3 引物與探針的設(shè)計(jì) Kageyama等[5]針對(duì)GI-NV、GII-NV的Orf1-Orf2連接處的高度保守序列設(shè)計(jì)引物和探針，以及Jothikumar等[6]針對(duì)A-RVNsp3基因高度保守序列設(shè)計(jì)引物和探針，是目前檢測(cè)NV和RV的最理想引物探針。因此，本試驗(yàn)參照參考文獻(xiàn)[5-6]建立三重?zé)晒舛縋CR方法，引物和探針由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物和探針序列見(jiàn)表1。

表1 熒光定量PCR引物和探針序列Table 1 Primer and probe sequences of fluorescent quantitative PCR

1.4 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備 以人工合成的含有GI-NV、GII-NV、A-RV目的基因片段的質(zhì)粒核酸為模板，使用PMV質(zhì)粒載體的通用測(cè)序引物M13F(5′-TGTAAAACGACGGCCAG-3′)和M13R(5′-CAGGAAACAGCTATGACC-3′)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增長(zhǎng)度分別為392 bp(GI-NV)、384 bp(GII-NV)和373 bp(A-RV)。PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。將擴(kuò)增產(chǎn)物連接克隆載體，制備成重組質(zhì)粒，然后進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行比對(duì)，將測(cè)序結(jié)果正確的陽(yáng)性重組質(zhì)粒作為GI-NV、GII-NV、A-RV的標(biāo)準(zhǔn)品。增菌培養(yǎng)含有重組質(zhì)粒的陽(yáng)性菌株，運(yùn)用質(zhì)粒小提試劑盒提取重組質(zhì)粒，NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定重組質(zhì)粒濃度，按照公式計(jì)算重組質(zhì)粒拷貝數(shù)：重組質(zhì)粒拷貝數(shù)(copies/μL)=(質(zhì)粒濃度×10-9×6.02×1023)/(660道爾頓/堿基×堿基數(shù))。用無(wú)菌水將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 三重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)條件的優(yōu)化 用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。參照熒光定量試劑盒說(shuō)明書(shū)所提供的反應(yīng)條件，優(yōu)化引物濃度、探針濃度和退火溫度。所有三重?zé)晒舛縋CR優(yōu)化反應(yīng)均采用GI-NV、GII-NV、A-RV相同濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，約108copies/μL。

1.6 三重?zé)晒舛縋CR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 按照已經(jīng)優(yōu)化好的三重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)條件，將3個(gè)重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品(濃度為1×1010copies/μL)等體積、等濃度均勻混合，然后再用稀釋液依次進(jìn)行10倍梯度稀釋直至1×100copies/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｒ?個(gè)10倍梯度稀釋濃度(1×108～1×102copies/μL)的新混合標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒作為模板，進(jìn)行三重?zé)晒舛縋CR擴(kuò)增，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算相關(guān)系數(shù)。

1.7 三重?zé)晒舛縋CR特異性試驗(yàn) 采用優(yōu)化好的三重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)條件和反應(yīng)體系，以GI-NV、GII-NV、A-RV、AstV、AdV、SaV的核酸為混合模板進(jìn)行多重?zé)晒舛縋CR擴(kuò)增，以檢驗(yàn)反應(yīng)體系的特異性。

1.8 三重?zé)晒舛縋CR靈敏性試驗(yàn) 將3個(gè)重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品(濃度為1×1010copies/μL)等體積、等濃度均勻混合，用稀釋液將重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品混合物稀釋成1×108～1×100copies/μL，作為模板，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照，進(jìn)行多重?zé)晒舛縋CR擴(kuò)增反應(yīng)，用來(lái)確定該方法的靈敏性。

1.9 三重?zé)晒舛縋CR重復(fù)性試驗(yàn) 選擇106、105copies/μL和104copies/μL 3個(gè)濃度的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度重復(fù)5次。組內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)：取3個(gè)濃度的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)濃度重復(fù)5次，計(jì)算變異系數(shù)CV(%)；組間重復(fù)性試驗(yàn)：取3個(gè)濃度的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)濃度重復(fù)5次，在相同條件下每隔7 d進(jìn)行1次檢測(cè)，共檢測(cè)5次，計(jì)算變異系數(shù)CV(%)。

1.10 動(dòng)物源食品樣品的檢測(cè) 運(yùn)用本試驗(yàn)建立的三重?zé)晒舛縋CR方法對(duì)109份動(dòng)物源食品樣品進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)采用商品化的GI-NV、GII-NV和A-RV核酸檢測(cè)試劑盒進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備 以人工合成的陽(yáng)性質(zhì)粒核酸為模板，使用通用測(cè)序引物M13F和M13R進(jìn)行擴(kuò)增，PCR結(jié)果如圖1所示。PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果顯示，合成的基因與NCBI上的完全一致，沒(méi)有出現(xiàn)突變，可以作為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。測(cè)定重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)：GI-NV為3.81×1010copies/μL，GII-NV為2.74×1010copies/μL，A-RV為3.35×1010copies/μL。將制備的3種重組質(zhì)粒用稀釋液稀釋成1×1010copies/μL，作為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r(shí)用無(wú)菌水將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋，稀釋度為1×108～1×100copies/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 重組質(zhì)粒的PCR鑒定Fig.1 PCR identification of recombinant plasmidM：DL2 000 DNA Marker；N：陰性對(duì)照(Negative control)；1：GI-NV(392 bp)；2：GII-NV(384 bp)；3：A-RV(373 bp)

2.2 三重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)條件 經(jīng)過(guò)對(duì)三重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)條件的多次試驗(yàn)，最后確定三重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)GI-NV、GII-NV、A-RV的最佳反應(yīng)體系：2×NovoStart?Probe qPCR SuperMix 25 μL，GI-F 0.5 μL，GII-F 0.5 μL，Nsp3-F 0.5 μL，GI-R 0.5 μL，GII-R 0.5 μL，Nsp3-R 0.5 μL，GI-P 1.2 μL，GII-P 1.2 μL，Nsp3-P 1.2 μL，GI-NV模板2 μL，GII-NV模板2 μL，A-RV模板 2 μL，RNase Free Water 12.4 μL，共計(jì)50 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 15 s，58 ℃ 1 min(收集熒光)，共40個(gè)循環(huán)。

2.3 三重?zé)晒舛縋CR標(biāo)準(zhǔn)曲線 利用優(yōu)化好的三重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)條件，將3個(gè)重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品用稀釋液進(jìn)行10倍梯度稀釋(1×108～1×102copies/μL)作為模板，進(jìn)行三重?zé)晒舛縋CR的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制，結(jié)果顯示，GI-NV、GII-NV和A-RV在3個(gè)對(duì)應(yīng)的熒光通道都有較好的線性關(guān)系。其中，GI-NV的相關(guān)系數(shù)R2=0.998 1，GII-NV的相關(guān)系數(shù)R2=0.996 7；A-RV的相關(guān)系數(shù)R2=0.995 1。質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)與Ct值的線性關(guān)系見(jiàn)圖2。

圖2 三重?zé)晒舛縋CR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of triple fluorescence quantitative PCRA：GI-NV； B：GII-NV； C：A-RV

2.4 三重?zé)晒舛縋CR特異性試驗(yàn) 特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，本試驗(yàn)建立的三重?zé)晒舛繖z測(cè)方法只能特異性的檢測(cè)到GI-NV、GII-NV和A-RV，其他病毒樣本均為陰性，表明該方法具有很好的特異性，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 三重?zé)晒舛縋CR特異性試驗(yàn)Fig.3 Specificity test of triple fluorescent quantitative PCRA：GII-NV； B：GI-NV； C：A-RV； D：陰性對(duì)照(Negative control)

2.5 三重?zé)晒舛縋CR靈敏性試驗(yàn) 將GI-NV、GII-NV、A-RV三種重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品混合后10倍系列稀釋，作為檢測(cè)模板，經(jīng)過(guò)檢測(cè)，當(dāng)設(shè)定Ct值≤35時(shí)，確定多重?zé)晒舛縋CR對(duì)GI-NV、GII-NV、A-RV最低檢出限均為1×102copies/μL，表明該方法靈敏度較高,結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 三重?zé)晒舛縋CR靈敏性試驗(yàn)Fig.4 Sensitivity test of triple fluorescent quantitative PCRA：GI-NV； B：GII-NV； C：A-RV

2.6 三重?zé)晒舛縋CR重復(fù)性試驗(yàn) 三重?zé)晒舛縋CR組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗(yàn)所用模板為106、105copies/μL和104copies/μL 3個(gè)濃度的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行5次，結(jié)果見(jiàn)表2和表3。NV和RV的檢測(cè)結(jié)果在組內(nèi)和組間的變異系數(shù)均小于5%，說(shuō)明建立的三重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法的重復(fù)性較好。

表2 三重?zé)晒舛縋CR重復(fù)性試驗(yàn)組內(nèi)結(jié)果Table 2 Within group results of triple fluorescence quantitative PCR repeatability test

表3 三重?zé)晒舛縋CR重復(fù)性試驗(yàn)組間結(jié)果Table 3 Inter group results of triple fluorescence quantitative PCR repeatability test

2.7 動(dòng)物源食品樣品檢測(cè) 利用本試驗(yàn)建立的GI-NV、GII-NV、A-RV三重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法對(duì)收集的109份動(dòng)物源食品進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)使用商品化的試劑盒進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，2種檢測(cè)方法的符合率達(dá)到100%，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 樣品檢測(cè)結(jié)果Table 4 Sample test results

在36份牛肉、18份豬肉、20份雞肉和35份海鮮(其中蝦15份、牡蠣20份)共計(jì)109份動(dòng)物源食品樣品中，共檢測(cè)出8份樣品中含有GI-NV、GII-NV、A-RV中的1種或者2種。具體結(jié)果：2份牛肉中檢出GII-NV；1份豬肉中檢出A-RV；雞肉中無(wú)檢出；1份蝦中同時(shí)檢出GI-NV和GII-NV；1份牡蠣中檢出GI-NV、1份牡蠣中檢測(cè)GII-NV、2份牡蠣中同時(shí)檢出GII-NV和A-RV。

3 討論

由諾如病毒和輪狀病毒污染食物所引起的非細(xì)菌性急性胃腸炎病越來(lái)越多，并且混合感染和繼發(fā)感染也較為普遍，給臨床診斷帶來(lái)很多困難[7-8]。熒光定量PCR檢測(cè)方法是近年來(lái)應(yīng)用較廣的新型核酸定量檢測(cè)技術(shù)，其具有靈敏度高、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)、污染少、節(jié)約時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)檢測(cè)、基因表達(dá)研究、細(xì)菌和病毒檢測(cè)等方面。王毅謙等[9]建立了基于Allglo探針技術(shù)同時(shí)檢測(cè)GI-NV和GII-NV的雙重?zé)晒舛縋CR方法；周冬梅等[10]建立了基于TaqMan探針技術(shù)同時(shí)檢測(cè)GI-NV和GII-NV的雙重?zé)晒舛縋CR方法；李凡[11]、陳峰等[12]建立了RV的熒光定量PCR檢測(cè)方法。但是針對(duì)NV和RV同時(shí)檢測(cè)的熒光定量PCR方法還很少見(jiàn)。本試驗(yàn)通過(guò)人工合成GI-NV、GII-NV、A-RV的保守序列，并通過(guò)PCR擴(kuò)增、DNA片段連接克隆載體，從而構(gòu)建了含有GI-NV、GII-NV、A-RV的保守序列的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，在重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的基礎(chǔ)上建立了同時(shí)檢測(cè)GI-NV、GII-NV、A-RV的多重?zé)晒舛縋CR方法。本試驗(yàn)之所以采用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板進(jìn)行研究，主要有以下原因：質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)于病毒基因組而言長(zhǎng)度較小，進(jìn)行PCR擴(kuò)增操作比較簡(jiǎn)便快捷，同時(shí)PCR擴(kuò)增過(guò)程不容易斷裂，而病毒基因組為RNA，具有容易降解的特性。在優(yōu)化多重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)條件時(shí)，采用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品能保證操作過(guò)程的穩(wěn)定性，同時(shí)還避免了每次試驗(yàn)都要進(jìn)行RNA提取、反轉(zhuǎn)錄等過(guò)程帶給試驗(yàn)的誤差。本試驗(yàn)建立的三重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)GI-NV、GII-NV、A-RV方法實(shí)現(xiàn)了一管三重檢測(cè)，3種病毒質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)靈敏度均為100 copies/μL，并且具有良好的特異性和重復(fù)性。本試驗(yàn)建立的三重?zé)晒舛縋CR方法能夠?qū)χZ如病毒和輪狀病毒進(jìn)行快速鑒別，并對(duì)諾如病毒和輪狀病毒的流行病學(xué)調(diào)查提供了有效的技術(shù)手段。