東北林蛙源致病性嗜水氣單胞菌的分離、鑒定及藥敏試驗

孟 欣 ， 孫大慶 ， 康元環 ， 張冬星 ， 單曉楓 ， 錢愛東

(吉林農業大學動物科學技術學院 ， 吉林 長春 130118)

東北林蛙(Ranadybowskii) 是蛙科、林蛙屬無尾兩棲動物，主要分布于我國東北地區和內蒙古東北部，其具有極高的經濟價值和科研價值，是我國重要的野生藥用動物[1]。由于大量的人為捕殺、自然生態的破壞、外來物種的侵入等外界因素影響[2]，導致野生東北林蛙的數量驟減，其已經被列入《世界瀕危動物紅皮書》二級保護動物，為易危(V)物種[3]。

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)隸屬于氣單胞菌科(Aeromonadaceae)、氣單胞菌屬，廣泛存在于淡水、污水和土壤中[4]，可誘發恒溫動物、變溫動物的全身性疾病，是一種典型的人—畜—魚共患的致病菌[5-6]。因其可在多種水體以及水產動物體內寄生，可引起蛙類致病甚至死亡，給蛙類人工養殖業和野生蛙類的生存均造成了嚴重的威脅，引起了眾多國內外學者的高度重視[7-8]。嗜水氣單胞菌能夠引起以蛙紅腿和皮膚潰爛壞死為特征的細菌性傳染病，常可引起急性出血性敗血癥等，病程短，傳播能力強，近年來此類病例正在以驚人的速度增多，造成了極高的死亡率[9-11]。本試驗對從吉林市某林蛙養殖場患病的東北林蛙臟器中分離純化出的病原菌進行培養與鑒定，并對其致病性和耐藥性進行檢測，以期為東北林蛙的疾病防控與嗜水氣單胞菌的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 患病林蛙和健康林蛙，均購自吉林市某林蛙養殖場；斑馬魚，購自長春某花鳥魚市場。

1.2 主要試劑 細菌基因組提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；細菌微量生化反應管(杭州天和生物試劑有限公司)；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(長春飛凱生物有限公司)；藥敏紙片(杭州濱河微生物試劑有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 病原菌的分離培養 觀察病蛙體表以及大腿根部等出現病灶的部位，無菌操作取其病料在LB培養基中進行病原菌分離培養；同時對病蛙麻醉后在無菌條件下進行剖檢，采集病蛙的肝臟、腎臟、脾臟和心臟，充分研磨制成混懸液，接種于LB培養基，于28 ℃恒溫條件下培養18 h。挑取不同顏色、形態、大小的優勢單菌落進行純培養。培養物于4 ℃保存備用。

1.3.2 細菌溶血活性檢測 將LB平板中的優勢菌群進行純化后，接種至哥倫比亞羊血瓊脂平板上，37 ℃培養12 h，觀察溶血圈，用毫米尺測量溶血圈的直徑，評價各優勢菌群的溶血活性。

1.3.3 動物回歸試驗 選擇具有溶血活性的菌株用PBS稀釋至相同濃度1×108CFU/mL，選擇健康林蛙作為試驗動物，腹腔注射稀釋菌液(100 μL/只)，連續觀察7 d，記錄死亡情況，對菌株致病性進行檢測。

1.3.4 斑馬魚半數致死濃度(LD50)測定 將分離的溶血活性及致病性兼有的菌株接種于LB培養基中恒溫培養24 h，用PBS進行稀釋，稀釋濃度依次為1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、10 CFU/mL和1 CFU/mL。選擇斑馬魚作為實驗動物，按照菌液稀釋梯度數將健康斑馬魚分為7個濃度組，每組10尾，以0.2 mL/尾的劑量對斑馬魚進行腹腔注射。每天觀察各組魚的發病情況和死亡情況，并進行記錄，計算菌株的LD50。

1.3.5 生理生化鑒定 將分離到的病原菌純培養物分別接種至生化反應管內，30 ℃溫箱中孵育12～24 h。根據說明書進行結果對比，進行生理生化鑒定。

1.3.6 分子生物學鑒定 取對數生長期的菌液，離心收集菌體，按照細菌基因組提取試劑盒說明書操作，提取細菌的總DNA。利用PCR對菌株的16S rDNA基因與gyrB管家基因進行擴增，引物序列見表1。將PCR產物進行電泳檢測，出現預期目的條帶后，按照試劑盒說明書進行膠回收，純化后送至長春庫美生物測序公司進行測序。將分離菌株的16S rDNA基因序列和gyrB基因序列經NCBI中的BLSAT檢測系統進行序列同源性分析后，選取對比匹配度較高的幾組基因，利用MEGA 6.0構建系統發育樹。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.3.7 毒力基因檢測 以分離菌株DNA為模板，采用PCR方法對氣溶素(aer)、細胞毒性腸毒素(act)、黏附素(Aha)、核酸酶(exu)、絲氨酸蛋白酶(ser)、脂肪酶(Lip)、密度感應系統調控基因(LuxS)這7種毒力基因進行檢測，引物信息見表1。

1.3.8 藥敏試驗 采用改良K-B紙片擴散法，取20 μL純化后的分離菌株，用接種環在培養基中均勻涂布，將制備好的藥敏片分別按標記好的位置緊貼在培養基的表面。將培養皿放置于30 ℃恒溫箱中培養8～12 h后，觀察其抑菌圈的直徑(mm)，以抑菌圈直徑大小作為判定敏感度高低的標準，判斷病原菌對藥物的敏感性。

2 結果

2.1 分離優勢菌株 觀察病蛙體表并無明顯病灶，但上肢及大腿根部出現了損傷以及不同程度的腫大現象。無菌條件下對病蛙進行剖檢，使用接種環劃線分離培養臟器中的病原菌。挑選形態不同的優勢菌株接種于培養基中劃線培養，結果得到5株優勢細菌，分別命名為R1、R2、R3、R4和R5。

2.2 細菌溶血活性檢測 對R1～R5菌株進行溶血活性檢測，測量其溶血圈的直徑，結果顯示：R1、R2菌株并無溶血活性；R3、R4、R5菌株均出現了溶血環，表明R3、R4、R5菌株均具有溶血活性。

2.3 動物回歸試驗 使用PBS將R3、R4、R5三株細菌的菌落數統一調至1×108CFU /mL，以100 μL/只的注射量對健康林蛙進行腹腔注射。結果顯示，只有注射R5菌株的林蛙出現了死亡現象，注射R1～R4菌株的林蛙均未出現死亡。根據回歸試驗結果，可以初步證明R5菌株具有較強致病性。

2.4 斑馬魚LD50測定 通過人工感染斑馬魚發現，注射1×106CFU/mL R5菌液的斑馬魚組在第1天就出現了死亡情況，并出現了明顯的行動緩慢、精神不振的現象，第2天死亡4尾，1周內死亡率達到80%。經計算，R5菌株對于斑馬魚的LD50達到1.26×103CFU，說明R5菌株具有較強的致病性。

2.5 生理生化鑒定 結果如表2所示，R5菌株可分解葡萄糖產酸產氣；可分解賴氨酸脫羧酶、氨基酸脫羧酶；可利用葡萄糖、阿拉伯糖等；不利用明膠、山梨醇等。符合嗜水氣單胞菌生理生化特征，判定分離菌為嗜水氣單胞菌。

表2 生化反應結果Table 2 Biochemical reaction results

2.6 分子生物學鑒定 對R5菌株的16S rDNA和gyrB基因進行PCR鑒定，測序后構建系統發育進化樹。結果如圖1和圖2所示，分離菌R5與嗜水氣單胞菌(GenBank登錄號：CP046954.1)的同源性高達98%。結果表明R5菌株與嗜水氣單胞菌親緣關系最近。綜合生化反應和分子水平鑒定結果，確定R5菌株為嗜水氣單胞菌。

圖1 R5菌株16S rDNA系統發育進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of 16S rDNA of R5 strain▲：本試驗分離的菌株；下同▲：Strain isolated in this experiment. The same as below

圖2 R5菌株gyrB系統發育進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of gyrB of R5 strain

2.7 毒力基因檢測 PCR 擴增結果如圖3所示，R5菌株攜帶6種毒力因子，分別是Lip、act、aer、ser、LuxS和Aha，大小分別為247、232、431、128、369 bp和1 082 bp。

圖3 毒力基因的PCR擴增Fig.3 PCR amplification of virulence genesM：DL2 000 DNA Marker; 1：Lip; 2：act; 3：aer;4：exu; 5：ser; 6：LuxS; 7：Aha

2.8 藥敏試驗 藥敏試驗結果如表3所示，R5菌株對慶大霉素、四環素、鏈霉素、氟苯尼考、氧氟沙星、環丙沙星、多黏菌素B、頭孢拉啶、頭孢噻肟、頭孢吡肟、復方新諾明敏感；對丁胺卡那、氯霉素中介；對氨芐西林具有耐藥性。

表3 分離菌株藥物敏感性試驗Table 3 Antibiotic sensitivity test of the isolated strains

3 討論

嗜水氣單胞菌是淡水養殖類動物暴發性傳染病的主要病原菌之一，是多種水生動物的原發性致病菌，此前即有水生動物感染嗜水氣單胞菌的病例報道[12-13]。由于嗜水氣單胞菌的生存條件與蛙類的生活環境極為相似，所以其對蛙類是一種致病力強大的致病菌，主要導致蛙類的皮膚潰爛以及紅腿病，進而導致敗血癥等疾病[14-15]。東北林蛙作為典型的陸生蛙類，在水中繁殖后再登陸入林，其生活環境不僅復雜并且對飼養要求高，極易受到外界環境的影響。由于兩棲動物的特殊習性，相較于其他動物更易出現群體間的疾病傳播，所以對于其疾病的防控不容小覷[16]。Huys等從出現出血性敗血癥的虎紋蛙體內分離出1株嗜水氣單胞菌，說明嗜水氣單胞菌易使蛙類感染致病，蛙類是該菌的主要宿主之一[17]。林蛙常患的疾病大部分具有傳染性，但針對林蛙的特效治療藥甚少，所以應重視林蛙的疾病防控，要做到最大程度上減少林蛙染病概率，制定多種疾病治療方案，才能有效提高林蛙人工養殖的經濟效益[18]。

本試驗從吉林市養殖場患病林蛙體內分離到5株優勢菌株，通過溶血活性檢測和動物回歸試驗分別檢測其致病性，結果顯示菌株R5對于東北林蛙具有較強的致病性，結合生理生化鑒定初步確定該菌株為嗜水氣單胞菌。由于不同來源的嗜水氣單胞菌具有不同的理化特性，所以有必要在生化鑒定的基礎上進行16S rDNA基因序列的分析鑒定[19]。目前，公認16S rDNA基因檢測技術可對微生物進行快速、精準的鑒定分析，是常用于鑒定病原菌的檢測方法之一，但由于該方法具有高度保守性，使其對于相似度很高的同屬物種的分辨能力較弱[20-21]。RNA聚合酶基因gyrB，與16S rDNA基因相比具有較高的替換率，在以核苷酸序列為基礎的細菌類別鑒定中可作為靶分子，有助于更加準確地確定種屬分類以及新物種的發現，可更準確地區分同源性較高的親緣物種[22-24]。因此，本試驗選取構建16S rDNA基因和gyrB管家基因的系統發育樹，對菌株R5進行后續的分子水平鑒定。結果顯示，R5菌株16S rDNA和gyrB基因序列與嗜水氣單胞菌(GenBank登錄號：CP046954.1)的同源性高達98%，進一步確定嗜水氣單胞菌是引起該養殖場東北林蛙患病的病原菌。

動物回歸試驗和斑馬魚LD50測定結果顯示，經人工感染純化后的R5菌株，可使東北林蛙和斑馬魚在短時間內死亡，證明該菌具有較強的致病性。嗜水氣單胞菌與其他病原微生物的致病過程基本一致，大致分為黏附、入侵、定植、增殖、產生毒素，其利用不同毒力因子調節自身的基因，從而來適應不同的要求[25]。一般認為，嗜水氣單胞菌致病作用與其攜帶的多種毒力因子(外毒素、胞外蛋白酶、黏附素)密切相關，可能是多功能和多因子相互協同作用的結果，毒力基因分布不同的菌株，致病性也存在一定的差異[26-28]。本試驗毒力因子檢測結果顯示，R5菌株可攜帶Lip、act、aer、ser、LuxS、Aha這6種毒力因子。嗜水氣單胞菌所產生的氣溶素和細胞毒性腸毒素，已被確定為主要的致病因子[29-30]，二者為典型的外毒素，具有腸毒性、溶血活性、細胞毒性等生物學特性，與動物出血病和敗血癥有關。氣溶素作為一種水溶性蛋白質，可在細胞表面形成具有通道孔的七聚體，導致細胞死亡，表現出血癥狀[31]，與本試驗林蛙體表出現紅腫的結果一致。絲氨酸蛋白酶廣泛存在于原核和真核細胞中，可以參與菌體的一些生化反應，進而影響菌株的毒力。研究發現，絲氨酸蛋白酶的表達與氣溶素的表達呈現正相關的關系[32-33]。LuxS基因可以促進細菌生物膜的形成，進而影響黏附能力以及溶血活性，使細菌的感染能力增強[34]。脂肪酶在激活氣單胞菌的氣溶素活性、增強細菌在宿主細胞中黏附能力等方面均具有重要作用[35]。當嗜水氣單胞菌侵襲機體時，其會在體內快速、大量繁殖，所產生的毒力因子單獨或協同作用，導致機體內細胞破壞，從而導致機體抵抗力降低，出現出血、敗血等病癥，嚴重時可引起死亡[36]。因此，進一步研究嗜水氣單胞菌的致病機制對于該菌的防治具有重要的意義。

目前關于嗜水氣單胞菌疫苗的研究已經有了顯著的進展，但由于制作成本以及技術等方面的原因，在水生動物細菌性疾病的防治中，傳統藥物和抗菌藥物依舊是常用的方法之一[37]。王闖等的藥敏試驗結果顯示，東北林蛙源嗜水氣單胞菌對氟喹諾酮類、氨基糖苷類抗菌藥以及部分頭孢類藥物敏感[38]，與本試驗結果基本一致，可見東北林蛙感染嗜水氣單胞菌可使用慶大霉素、環丙沙星、頭孢拉啶等藥物嘗試治療。但菌株R5對于氨芐西林耐藥，說明此次引發東北林蛙致病的病原菌具有較高的耐藥性，可能與曾長期使用或不科學使用抗菌藥，導致該病原菌株產生多重耐藥性相關。由于近年來水產養殖產業中濫用抗菌藥的現象層見迭出，其所導致的水環境污染以及大量耐藥菌株的產生成為了科研人員與養殖戶所要面臨的嚴峻問題[39]。所以在養殖過程中要有針對性地選擇敏感性藥物，并交替使用不同類別的抗菌藥物，盡可能避免抗藥菌株的產生。利用抗菌藥對感染嗜水氣單胞菌的蛙類進行治療只是權宜之計，嗜水氣單胞菌的防治仍需不斷地進行探索和改進，需要“以防為主，防治結合”的綜合防治方法[40]。尋找替代抗菌藥物的相關研究也成為了當下水產養殖業對動物疾病防治的重要研究方向，這也對我國綠色健康的水產養殖環境的形成有著重大的意義。