lncRNA PVT1靶向調(diào)控miR-625-5p對(duì)高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的影響及其機(jī)制

黃 嵐，張洪波，莊 紅

糖尿病心肌病是糖尿病的主要并發(fā)癥，這也是糖尿病患者病死率高的原因之一，對(duì)患者生命健康帶來(lái)嚴(yán)重威脅[1]。心肌細(xì)胞凋亡是糖尿病心肌病的主要發(fā)病機(jī)制[2]，但其具體機(jī)制還未闡述清楚。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)與心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等過(guò)程密切相關(guān)，可加速心肌細(xì)胞凋亡，引起一系列病變發(fā)生，包括糖尿病心肌病[3-4]。漿細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)化遷移基因1(PVT1)是一種在鼠漿細(xì)胞瘤內(nèi)發(fā)現(xiàn)的致癌lncRNA，位于染色體8q24區(qū)域，可參與多種疾病的發(fā)展[5]。有研究表明，高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中PVT1呈高表達(dá)，下調(diào)PVT1可減輕高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，起到保護(hù)心肌細(xì)胞的作用[6]。在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)顯示，miR-625-5p是PVT1靶基因之一，miR-625-5p在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，并通過(guò)靶向調(diào)控STAT3/CaMKII減輕心肌肥大[7]。但是關(guān)于miR-625-5p對(duì)高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的研究少見報(bào)道。鑒于此，本研究主要探討lncRNA PVT1靶向調(diào)控miR-625-5p對(duì)高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞與試劑 心肌H9c2細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞中心；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、葡萄糖購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；si-NC、si-PVT1、miR-NC、miR-625-5p、anti-miR-NC、anti-miR-625-5p及相關(guān)引物均購(gòu)自上海吉瑪生物科技有限公司；Lipofectamine 2000試劑盒、TRIzol試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；凋亡試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；Cleaved-caspase3抗體、Bax抗體、GAPDH抗體、HRP標(biāo)記的二抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；RIPA試劑、BCA試劑盒、ECL試劑、雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)試劑盒、白細(xì)胞介素-6(IL-6)試劑盒購(gòu)自上海酶研生物科技有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與分組 使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)心肌H9c2細(xì)胞，置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H9c2細(xì)胞接種于96孔板中，當(dāng)細(xì)胞融合度為70%時(shí)，棄去培養(yǎng)基，更換為不含胎牛血清培養(yǎng)基，用5.5、30.0 mmol/L葡萄糖干預(yù)48 h，分別記為NG組、HG組；按照脂質(zhì)體法將si-NC、si-PVT1、miR-NC、miR-625-5p、si-PVT1+anti-miR-NC、si-PVT1+anti-miR-625-5p轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞，然后用30.0 mmol/L葡萄糖干預(yù)48 h，分別記為HG+si-NC組、HG+si-PVT1組、HG+miR-NC組、HG+miR-625-5p組、HG+si-PVT1+anti-miR-NC組、HG+si-PVT1+anti-miR-625-5p組。

1.3qRT-PCR檢測(cè)PVT1、miR-625-5p表達(dá)量 各組H9c2細(xì)胞使用TRIzol試劑盒提取總RNA，檢測(cè)其濃度和純度后，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以其為模板，并配置20 μl反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增。分別以GAPDH、U6為內(nèi)參，應(yīng)用2-ΔΔCt法計(jì)算PVT1、miR-625-5p表達(dá)量。PVT1正向引物：5'-CCTGGTGAAGCATCTGATGCACG-3'，反向引物：5'-GCCAGGCTTTGTGGCACACGC-3'；GAPDH正向引物：5'-CGAGAATGGGAAGCTTGTC-3'，反向引物：5'-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3'。miR-625-5p正向引物：5'-ACTCCAGCTGGGAGGGGAAAGTTCTATAG-3'，反向引物：5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'；U6正向引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 使用PBS沖洗各組H9c2細(xì)胞，結(jié)束后加400 μl緩沖液制備成細(xì)胞懸液，先后依次加入10 μl Annexin V-FITC和5 μl PI試劑，混勻避光反應(yīng)30 min，加100 μl緩沖液，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.5Western blot檢測(cè)Cleaved-caspase3、Bax蛋白表達(dá) 各組H9c2細(xì)胞加入RIPA試劑，置于冰上30 min，離心10 min取上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度，將上樣緩沖液加熱變性5 min，行SDS-PAGE凝膠分離，轉(zhuǎn)膜后使用脫脂奶粉封閉90 min，加入一抗Cleaved-caspase3(1∶800)、Bax(1∶800)、GAPDH(1∶1000)稀釋液4 ℃條件下孵育過(guò)夜，次日加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶5000)稀釋液，室溫孵育90 min，將ECL試劑滴在膜內(nèi)，顯色、曝光。應(yīng)用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.6ELISA法檢測(cè)TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)水平 各組H9c2細(xì)胞離心結(jié)束后，取上清液按照試劑盒說(shuō)明書操作步驟，分別檢測(cè)上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)水平。

1.7雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PVT1與miR-625-5p的靶向關(guān)系 通過(guò)在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)顯示PVT1與miR-625-5p存在結(jié)合位點(diǎn)，然后擴(kuò)增含miR-625-5p結(jié)合位點(diǎn)的PVT1序列，插入pMIR-REPORT載體，分別構(gòu)建野生型、突變型PVT1序列，即WT-PVT1、MUT-PVT1。將對(duì)數(shù)期H9c2細(xì)胞接種24孔板內(nèi)，待融合至70%時(shí)，將WT-PVT1、MUT-PVT1分別與miR-NC或miR-625-5p共轉(zhuǎn)染至H9c2細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞按照雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)其熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1PVT1在高糖誘導(dǎo)心肌H9c2細(xì)胞中的表達(dá) NG組PVT1表達(dá)量為1.00±0.09，HG組為4.11±0.37，HG+si-NC組為4.14±0.40，HG+si-PVT1組為2.37±0.21。與NG組比較，HG組PVT1表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；與HG+si-NC組比較，HG+si-PVT1組PVT1表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。

2.2干擾PVT1對(duì)高糖誘導(dǎo)心肌H9c2細(xì)胞凋亡的影響 與NG組比較，HG組Cleaved-caspase3、Bax蛋白表達(dá)及凋亡率顯著升高(P<0.05)；與HG+si-NC組比較，HG+si-PVT1組Cleaved-caspase3、Bax蛋白表達(dá)及凋亡率顯著降低(P<0.05)。見表1、圖1和2。

表1 干擾PVT1對(duì)高糖誘導(dǎo)心肌H9c2細(xì)胞Cleaved-caspase3、Bax蛋白表達(dá)及凋亡率的影響

2.3干擾PVT1對(duì)高糖誘導(dǎo)心肌H9c2細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響 與NG組比較，HG組TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與HG+si-NC組比較，HG+si-PVT1組TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 干擾PVT1對(duì)高糖誘導(dǎo)心肌H9c2細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)水平的影響

2.4PVT1靶向調(diào)控miR-625-5p分析 在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)顯示，PVT1與miR-625-5p存在互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)。見圖3。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示，與miR-NC組比較，miR-625-5p組MUT-PVT1熒光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，WT-PVT1熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)。見表3。NG組miR-625-5p表達(dá)量為1.01±0.07，HG組為0.32±0.05，HG+si-NC組為0.33±0.04，HG+si-PVT1組為0.74±0.08。與NG組比較，HG組miR-625-5p表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；與HG+si-NC組比較，HG+si-PVT1組miR-625-5p表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5過(guò)表達(dá)miR-625-5p對(duì)高糖誘導(dǎo)心肌H9c2細(xì)胞損傷的影響 與HG+miR-NC組比較，HG+miR-625-5p組miR-625-5p表達(dá)量顯著升高，凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白、Bax蛋白、TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見圖4、表4和5。

表4 過(guò)表達(dá)miR-625-5p對(duì)高糖誘導(dǎo)心肌H9c2細(xì)胞Cleaved-caspase3、Bax蛋白表達(dá)及凋亡率的影響

表5 過(guò)表達(dá)miR-625-5p對(duì)高糖誘導(dǎo)心肌H9c2細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)水平的影響

2.6抑制miR-625-5p對(duì)干擾PVT1后高糖誘導(dǎo)心肌H9c2細(xì)胞損傷的影響 與HG+si-PVT1+anti-miR-NC組比較，HG+si-PVT1+anti-miR-625-5p組miR-625-5p表達(dá)量顯著降低，凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白、Bax蛋白、TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見圖5、表6和7。

表7 抑制miR-625-5p對(duì)干擾PVT1后高糖誘導(dǎo)心肌H9c2細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)水平的影響

3 討論

糖尿病是常見的代謝疾病，且大部分患者伴有心血管疾病，而糖尿病心肌病較為常見[8-9]。長(zhǎng)期高血糖可引起心肌細(xì)胞糖脂代謝失衡，進(jìn)一步促進(jìn)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)的發(fā)生，進(jìn)而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，可加重糖尿病心肌病的發(fā)生[10-13]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞后，其凋亡率、TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)水平增加，而Cleaved-caspase3、Bax蛋白表達(dá)也明顯上調(diào)，與上述研究結(jié)果相似。

lncRNA在進(jìn)化上高度保守，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，其與糖尿病心肌病發(fā)生密切相關(guān)，其中DCRF、MEG3、HOTAIR等已被證實(shí)，并有望成為糖尿病心肌病的潛在治療靶點(diǎn)[14-15]。還有研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病心肌病患者血清TINCR低表達(dá)，上調(diào)TINCR可明顯抑制高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[16]。有研究結(jié)果顯示，HOTAIR在糖尿病心肌組織和血清中低表達(dá)，上調(diào)HOTAIR可通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路改善糖尿病心肌病進(jìn)展[17]。高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞后KCNQ1OT1高表達(dá)，并可通過(guò)調(diào)控miR-181a-5p/PDCD4軸減輕高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)[18]。PVT1在心臟毒性、心肌缺血再灌注損傷中高表達(dá)，可通過(guò)調(diào)控miR-187-3p或miR-214-3p促進(jìn)疾病發(fā)展[19-20]。本研究結(jié)果顯示，高糖誘導(dǎo)心肌H9c2細(xì)胞后PVT1表達(dá)量增加，干擾PVT1可降低高糖誘導(dǎo)心肌H9c2細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)水平及凋亡率，并下調(diào)Cleaved-caspase3、Bax蛋白表達(dá)，提示干擾PVT1能減輕高糖誘導(dǎo)心肌H9c2細(xì)胞的損傷。

PVT1可通過(guò)調(diào)控下游miRNA參與心肌細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)等過(guò)程，進(jìn)而加快疾病發(fā)展[21-22]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PVT1與miR-625-5p存在相互結(jié)合的位點(diǎn)，雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示，過(guò)表達(dá)miR-625-5p可降低WT-PVT1熒光素酶活性，但對(duì)MUT-PVT1熒光素酶活性無(wú)影響，再次證明PVT1可靶向調(diào)控miR-625-5p表達(dá)。miR-625-5p在多種疾病中差異表達(dá)，如脂多糖刺激人支氣管上皮細(xì)胞miR-625-5p表達(dá)上調(diào)，并通過(guò)靶向AKT2減輕脂多糖誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)[23]。有研究顯示，在構(gòu)建體外急性肺損傷模型中miR-625-5p表達(dá)上調(diào)，miR-625-5p可通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路減輕急性肺損傷的肺部炎癥反應(yīng)[24]。但是在小兒哮喘中miR-625-5p低表達(dá)，可通過(guò)調(diào)控CBL/ESR1表達(dá)減輕塵螨誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[25]。先前研究顯示，miR-625-5p在心肌肥大患者中低表達(dá)[7]，但是對(duì)糖尿病心肌病未知。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖誘導(dǎo)心肌H9c2細(xì)胞后miR-625-5p表達(dá)量降低，干擾PVT1可增加miR-625-5p表達(dá)量，提示PVT1靶向負(fù)調(diào)控miR-625-5p，且過(guò)表達(dá)miR-625-5p可抑制高糖誘導(dǎo)心肌H9c2細(xì)胞的凋亡和炎癥反應(yīng)。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，抑制miR-625-5p可逆轉(zhuǎn)干擾PVT1對(duì)高糖誘導(dǎo)心肌H9c2細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的影響，提示PVT1可靶向負(fù)調(diào)控miR-625-5p減輕高糖誘導(dǎo)心肌H9c2細(xì)胞損傷。

綜上所述，干擾PVT1可減輕高糖誘導(dǎo)心肌H9c2細(xì)胞的凋亡和炎癥反應(yīng)，與負(fù)調(diào)控miR-625-5p表達(dá)有關(guān)。