巨自噬與細胞泡沫化在動脈粥樣硬化中的研究進展

楊永兆 陳 鵬

隨著人們生活水平的提高和全球人口老齡化的加劇，心血管疾病(cardiovascular diseases, CVDS)已成為威脅人類生命健康的主要因素之一，其發生率和病死率已經超過惡性腫瘤而躍居首位，成為近年來主要疾病負擔。作為CVDS的主要發病基礎，動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)與缺血性心臟病、缺血性腦卒中和外周動脈疾病等密切相關。據文獻報道，富含膽固醇酯的泡沫細胞(foam cell, FC)是AS斑塊的重要組成部分，FC壞死會誘發大量炎性細胞因子釋放，并最終導致AS斑塊的進展和不穩定。因此，在逆轉AS進程方面，阻止FC形成和壞死一直備受關注。即使有各種各樣的藥物和療法可用，但目前仍沒有針對FC來治療AS的有效方法。已有研究表明，自噬可以促進脂滴降解為膽固醇，并促進后者的外排，有利于AS的轉歸，提示通過靶向調節自噬，減少FC內脂質沉積有望成為AS治療的新策略。本文就自噬在細胞泡沫化形成中的作用與AS的關系做重點闡述，為AS的防治研究提供理論依據。

一、細胞泡沫化與AS

血管內皮細胞(vascular endothelial cell, VEC)、血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)和巨噬細胞(macrophages, M?)是AS發生、發展過程中的3種關鍵細胞，都參與了FC的形成。FC根據來源不同被劃分為兩類，即M?源性FC和VSMC源性FC。

M?源性FC的形成是AS早期病變的標志性事件。早期內皮損傷后，伴隨著炎癥的發生，VEC通透性增強，低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)攜帶大量膽固醇透過VEC，聚集到VEC的間隙中，隨后VEC表達單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein 1, MCP-1)和血管細胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule 1, VCAM-1)，誘導單核細胞黏附到血管內膜并分化為M?，M?被激活后，通過產生NO、超氧化物陰離子、羥基自由基等活性氧介導LDL氧化修飾，形成氧化型低密度脂蛋白膽固醇(oxidized low density lipoprotein cholesterol, ox-LDL-C)，隨后ox-LDL-C被M?表達的清道夫受體CD36、CD68、SR-A、SRB1等迅速識別，M?捕獲吞噬修飾后的LDL，導致大量膽固醇在胞內蓄積，進而轉化為FC，隨著M?泡沫化程度的加深和非受體介導的大顆粒脂蛋白吞噬，膽固醇酯在胞內不斷堆積，形成早期脂質條紋病變。

長期以來，人們一直認為AS病變部位的FC全部來源于M?，然而，有研究者在人體的研究中發現，VSMC也是FC的主要來源之一。AS的發展期，在血小板源生長因子(platelet derived growth factor, PDGF)和成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)的共同刺激下，位于動脈中膜的VSMC遷入內膜，與M?類似，VSMC在炎癥刺激下發生表型轉化，轉化為具有與M?相似吞噬功能的細胞，大量攝取ox-LDL形成FC，隨著VSMC源性FC的大量聚集，斑塊纖維帽形成。

無論是M?源性FC還是VSMC源性FC，它們都參與了斑塊的形成和發展。早期M?源性FC在內膜的聚集，促進了脂紋的形成，隨著脂質的不斷堆積，大量VSMC發生增殖、遷移和表型轉化，在內膜中蓄積吞噬脂質，位于脂紋深層的VSMC會發生凋亡，引起M?進一步積聚和微泡，而后者可以鈣化，促進脂紋轉化為纖維斑塊，斑塊中膽固醇在FC里大量沉積，會導致FC分泌基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)，降解斑塊中的膠原纖維，同時FC通過凋亡、自噬等機制不斷死亡吸引更多的M?遷移到內膜區域，形成惡性循環，進一步加劇AS斑塊的不穩定性。總之，FC堆積是AS的標志，其數量反映了AS發病的嚴重程度。

二、細胞自噬及其調控因子

細胞自噬(autophagy)是一種主要通過形成溶酶體系統來降解自身受損細胞器、異常蛋白等物質的生理過程。當細胞受到理化刺激，如饑餓、缺氧時，可通過自噬的方式來維持細胞的健康狀態。根據細胞內物質的轉運方式和降解機制的不同，可將自噬分為3類，即巨自噬、微自噬和分子伴侶介導的自噬。其中巨自噬參與了AS脂質代謝過程，因此，本文主要綜述巨自噬在細胞泡沫化中的作用。

由于自噬在生物進化過程中高度保守，其調控機制十分復雜，至今尚未完全闡明。目前，與調控細胞自噬有關的基因被統一命名為自噬相關基因(autophagy-related gene, ATG)，這些基因編碼的不同蛋白參與了細胞自噬過程的各個環節，形成了多個復雜的調控網絡。其中微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)、Beclin1、p62等是自噬調控的關鍵蛋白，可作為自噬發生的標志。Beclin1是Atg6在哺乳動物中的同源基因，在自噬的起始階段，其與Ⅲ型磷脂酰肌醇-3-激酶(PIKⅢ)形成復合物，募集自噬特異性蛋白定位到自噬泡，參與自噬體的形成，其表達量隨著自噬程度加深而增加。此外，unc-51樣激酶1(Ulk1)在這個過程中會與Atg5、Atg12、Atg13和Atg16相互作用，之后泛素樣蛋白Atg12和Atg8/LC3結合，參與自噬體的延伸和成熟。與Beclin1類似，LC3是Atg8在哺乳動物中的同源物，包括LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種亞型。在自噬體形成過程中，LC3-Ⅰ經泛素化處理轉化為LC3-Ⅱ，之后LC3-Ⅱ靶向結合到自噬體膜上，促進自噬體的成熟，LC3-Ⅱ的含量或LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的值與自噬泡的數量呈正相關。最終，成熟的自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，此時，多功能蛋白p62可將泛素化底物連接到自噬小體中，使泛素化的底物降解，同時自身也被降解。而降解過程形成的小分子物質又可為細胞代謝提供營養和原料。這個階段，p62蛋白的升高，提示細胞自噬活性受到抑制。

三、巨自噬與細胞泡沫化

1.概述：在AS發展過程中，過量的游離膽固醇對VSMC和M?來說是有毒的，為了維持自身的正常生理功能，二者會啟動復雜的反饋機制來減少膽固醇的攝入，當膽固醇代謝失衡后，膽固醇酯便在VSMC和M?中積聚形成FC。現有證據表明，FC中的脂滴主要由膽固醇酯構成，自噬激活有利于脂滴降解為膽固醇并促進其逆向轉運，減少脂質在FC中的聚積，從而抑制FC的形成，延緩AS進展。因此，自噬對維持VSMC和M?脂質代謝平衡顯得尤為重要。

2.巨自噬與巨噬細胞泡沫化：M?是一種基本的免疫吞噬細胞，在AS斑塊中大量存在，參與了AS發生、發展的全過程，M?源性FC的出現被認為是AS早期的關鍵信號。Yang等指出，自噬可減輕斑塊內M?浸潤和泡沫化程度，在高脂飼料喂養的載脂蛋白E基因缺失(ApoE)小鼠中，抑制能誘導自噬的調節因子SIRT1后，ApoE小鼠AS病變部位斑塊面積增大，FC增多。此外，在ox-LDL誘導的M?源性FC模型中，通過敲除SIRT1引起自噬缺陷，M?中p62的表達升高，同時Beclin1和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的值均降低，M?泡沫化增強，而過表達SIRT1后上述情況出現逆轉，表明自噬能保護M?免受脂質侵害。然而，該研究主要使用體外研究的方法，具有一定局限性，面對復雜的體內微環境，SIRT1是否控制ApoE小鼠的自噬過程還需要進一步驗證。Wang等同樣認為M?自噬可減少FC形成，抑制AS發展，敲除基因SIRT6后，M?中p62的表達升高，LC3-Ⅱ表達降低，自噬受損，M?源性FC形成增多，加劇了AS斑塊的不穩定性，而過表達SIRT6顯著增加了M?的自噬通量，FC形成減少的同時，還抑制了血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)、細胞間黏附分子-1(ICAM-1)和P-選擇素的表達，使M?和FC的浸潤均減少，斑塊穩定性增加。另有研究發現，通過激活SIRT1介導的自噬，可促進M?向M2型轉化，減少FC的形成并減輕AS。上述研究表明，上調自噬對M?泡沫化具有保護作用，但所選靶基因均過于單一，仍有許多靶點尚待探索。

3.巨自噬與血管平滑肌細胞泡沫化：與M?源性FC比較，VSMC源性FC形成后會穩定存在于AS斑塊中無法脫離，因此，VSMC源性FC的形成和發展可能與斑塊穩定性關系更大。當VSMC內脂質代謝失衡時，自噬會被激活。Li等研究證實，自噬激活可減少VSMC內脂質堆積，抑制其泡沫化，在原代培養的小鼠胸主動脈VSMC中，通過ox-LDL誘導泡沫化模型，敲除自噬相關基因Atg7，自噬受到抑制，VSMC內脂滴堆積增加并伴隨膽固醇水平升高，當激活PPARγ介導的自噬途徑后，VSMC中Beclin1的表達和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的值均顯著增加，VSMC泡沫化程度減弱。此外，Li等的另一項研究再次證實了自噬對VSMC泡沫化的保護作用，在ApoE小鼠中，特異性敲除VSMC中SCAP(一種膽固醇傳感器)后，小鼠斑塊中自噬相關蛋白p62表達降低，LC3表達升高，小鼠斑塊面積減小，此外，在SCAP敲除的VSMC中，自噬體數量增加，p62表達水平降低，自噬被激活，VSMC中的脂質積累減少，其泡沫化程度降低。在近年來的一項研究中也得出了與上述同樣的結論，在敲除自噬必須基因Atg5后，自噬缺失，VSMC內膽固醇外排受阻，脂質沉積增加，促進了VSMC源性FC的形成。以上研究說明，自噬在調節VSMC源性FC形成中起著難以替代的作用，但這些研究應用的主要是體內模型，對于體外模型仍有待于深入研究。

四、以巨自噬調控細胞泡沫化為靶點的AS防治策略探索

AS是一種與脂質代謝紊亂相關的慢性炎癥性疾病，其特征是脂質的異常積累和FC的大量沉積。作為AS的主要病理成分之一，FC的蓄積會加劇斑塊的不穩定性，因此，抑制FC的形成可以有效預防AS和急性心血管事件的發生。大量研究表明，自噬通過調節脂質代謝參與了FC的形成，自噬的激活可以減少細胞內脂質的積累并促進膽固醇流出，從而減緩AS的發展。Zheng等研究發現，阿托伐他汀通過AMPK/mTOR途徑促進脂肪自噬來抑制FC的形成。于紅紅等研究證實，黃連解毒湯含藥血清可以通過Akt/mTOR通路激活自噬抑制M?源性FC形成，以起到抗AS作用。Ma等研究表明，毛蕊異黃素(calycosin)通過上調KLF2-MLKL介導的自噬來抑制ApoE小鼠AS斑塊中的細胞泡沫化，增強了斑塊穩定性。另有研究發現，天麻素可通過激活AMPK-FoxO1-TFEB信號軸誘導溶酶體生物發生和細胞自噬，從而增強細胞內的膽固醇外流，減少了脂質的積聚并防止了FC的形成。此外，丁暢等在體外AS模型中研究發現，荷葉堿可抑制PIK/Akt/mTOR信號通路激活自噬來減少FC的形成并改善AS。值得一提的是降糖藥二甲雙胍也可以通過激活自噬對CVDS起到保護作用。近年來Wu等在小鼠AS模型中研究二甲雙胍，發現了其通過激活KLF2介導的自噬抑制細胞泡沫化來抗AS的新機制。由此可見，有較多研究支持自噬通過調控細胞泡沫化改善AS病變，并且對藥物的研究并不局限于傳統的抗AS藥物。

五、展 望

M?和VSMC是構成AS病灶中的兩大主要細胞，在推動AS病程發展過程中起著至關重要的作用。此外，AS病變標志物FC，來源于脂質代謝失衡的M?和VSMC，FC的大量形成和堆疊壞死是推動AS斑塊朝不穩定方向發展的罪魁禍首。作為細胞維持正常生理功能的途徑，自噬在調控FC內脂質運輸，維持膽固醇穩態方面作用顯著。因而，從細胞自噬調控M?和VSMC泡沫化的角度來探索AS的防治無疑是一個更有前景的方向。盡管在過去的幾年中，AS與自噬的報道逐漸增多，但我們對這一領域仍然知之甚少，還有許多問題有待于闡明。值得留意的是，自噬的激活并不總是有利于AS的治療。自噬的過度激活會導致FC自噬性死亡，促進AS發展。考慮到自噬的雙重效應，未來需要進一步權衡自噬對AS的抑制和促進作用，根據AS發生、發展和病理變化的情況來精準把控干預自噬的時間點、自噬激活的強度和持續時間，確保對自噬的調控總是朝著對AS病情有利的方向發展。對于治療藥物而言，目前已經報道了許多自噬誘導劑對AS的有利作用，但這些藥物大都對多種細胞自噬都有調控功能，缺乏特異性。開發出安全性更高、靶向性更強的藥物仍然是未來藥物研發的目標。另外，目前對于自噬的研究還主要集中在PIK/Akt/mTOR這條經典通路上，其他通路的研究還有待于拓展。總之，通過干預自噬調控M?和VSMC泡沫化來防治AS及以自噬為著力點的藥物開發將是未來很長一段時間的研究熱點之一。