春小麥主要籽粒性狀的全基因組關聯分析

嚴勇亮，張 恒，張金波，時曉磊，耿洪偉，肖 菁，路子峰，倪中福，叢 花

(1. 中國農業大學農學院，北京 100193；2. 新疆農業科學院農作物品種資源研究所，新疆烏魯木齊 830091;3. 新疆農業科學院國際科技合作交流處，新疆烏魯木齊 830091；4. 新疆農業大學農學院/農業生物技術重點實驗室，新疆烏魯木齊 830052)

小麥是中國主要糧食作物之一，其產量高低直接關系國家糧食安全。培育高產小麥新品種是提高產量最直接有效的方法，而小麥種質資源的遺傳分析對小麥遺傳改良具有重要作用。小麥籽粒性狀與產量關系密切，對小麥最終產量形成有重要作用。在育種工作中通常通過改良籽粒性狀來提高小麥產量，但傳統育種方法盲目性大、效率較低，導致品種同質化嚴重，分子標記輔助選擇(marker-assisted selection，MAS)技術的發展，有助于提高選擇效率和可預測性，進而加速育種進程。

小麥的千粒重、粒長、粒寬等籽粒性狀是由多基因控制的數量性狀，受基因和環境共同調控，QTL定位和全基因組關聯分析(genome wide association study，GWAS)是研究數量性狀的主要方法。GWAS是以連鎖不平衡為基礎，在全基因組水平上對自然群體目標性狀的遺傳變異與基因多樣性進行關聯，篩選出與表型變異相關的分子標記的一種方法，也被稱為連鎖不平衡作圖。傳統的QTL定位精度較低，只能將目標QTL定位在5～20 cM的基因組區間內，相較于雙親連鎖分析，GWAS考慮了更加復雜的遺傳背景，在解析小麥數量性狀遺傳基礎方面的應用越來越廣泛。前人以不同來源的小麥品種(系)為材料，利用小麥SNP和SSR標記并結合GWAS，在除1A、1D、3D、4D和6A之外的16條小麥染色體上發現了大量與千粒重顯著關聯的位點，表型貢獻率為6.7%～ 13.0%；在除6B之外的20條染色體上發現了大量與小麥粒長顯著關聯的位點，其表型貢獻率為2.40%～ 53.84%；在除1B、1D、2D、6D和7B之外的16條染色體上發現了大量與小麥粒寬顯著關聯的位點，其表型貢獻率為2.80%～47.12%。

SNP標記在基因組中具有分布廣、數量多以及定位精度高等特點，被廣泛應用于育種工作中。新疆作為中國小麥主產區之一，小麥產量的提升至關重要。但常規育種手段跟不上生產需求，需對分子標記等新技術進行充分使用，但基于高密度芯片技術對新疆小麥籽粒性狀的GWAS鮮有報道。因此，本研究以298份新疆種植的春小麥品種為材料，利用55K SNP基因芯片對5個環境下的千粒重、粒長、粒寬3個主要籽粒性狀進行GWAS分析，以期獲得新的控制小麥籽粒性狀的遺傳位點，并挖掘相關的候選基因，為精細定位、基因克隆和分子標記輔助選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試驗設計

以298份新疆種植的春小麥品種為材料，其中國外引進品種110份、新疆地方品種141份、新疆育成品種47份，該群體在一定程度上反映了不同時期適合新疆地區種植的小麥種質特性。于2018、2019、2020連續3年將供試材料種植于新疆烏魯木齊市新疆農業科學院安寧渠基地，分別簡稱為E1、E2、E4；于2019、2020連續2年將供試材料也種植于新疆喀什市新疆農業科學院澤普小麥育種家基地，分別簡稱為E3和E5。采用隨機區組設計，每份材料種植3行，行長2 m，行距20 cm，3次重復，人工播種。在試驗田四周設置保護行，大田管理同當地農田基本栽培管理措施。

1.2 測定項目與方法

1.3 SNP分型與全基因組關聯分析(GWAS)

本課題前期利用小麥基因組55K SNP芯片對供試材料進行基因分型，并進行了群體結構分析和連鎖不平衡分析。本研究利用TASSEL 5.0軟件中的Q+K混合線性模型MLM對298份小麥品種在5個不同環境下的3個籽粒性狀進行GWAS，以=0.001為閾值，判定SNP標記與目標性狀關聯的顯著性。以LD衰減距離(8 Mb)作為候選基因的預測區間，將多個環境中穩定出現的SNP標記的延伸序列在小麥TGAC v1.0數據庫(http://plants.ensembl.org/hmmer/index.html)和NCBI網站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進行BLASTX，對候選位點進行功能注釋。

2 結果與分析

2.1 籽粒性狀表型統計分析結果

從表1可以看出，國外引進品種、新疆地方品種和新疆育成品種的3個主要籽粒性狀(千粒重、粒長、粒寬)有一定的差異，三種類型小麥在5個環境下的變異系數分別為4.95%～19.77%、 5.04%～17.39%和3.89%～17.41%，其中粒寬的變異幅度最小，千粒重的變異幅度最大。不同環境中，新疆育成品種的3個籽粒性狀的平均值均高于國外引進品種和新疆地方品種，新疆地方品種的3個籽粒性狀的平均值均最低。方差分析結果表明，基因型、環境以及基因型與環境互作對于春小麥籽粒性狀均有極顯著影響，千粒重、粒長和粒寬的遺傳力分別為0.92、0.94和 0.87，說明3個籽粒性狀受遺傳因素的影響較大。

2.2 全基因組關聯分析(GWAS)結果

利用TASSEL 5.0軟件中的Q+K混合線性模型MLM，并結合55 K基因芯片的23 632個SNP標記，對298份小麥品種在5個環境下的3個籽粒性狀進行GWAS，結果共定位到84個同時在2個及2個以上環境中顯著關聯的穩定SNP標記，它們分布在小麥21條染色體上，可解釋3.74%～11.18%的表型變異。檢測到23個與千粒重顯著關聯的標記，它們分布在除2A、4D、5D、6D和7B之外的16條染色體上，可解釋3.85%～9.25%的表型變異，其中在5B染色體上檢測到3個與千粒重顯著關聯的標記。檢測到54個與粒長顯著關聯的標記，它們分布在除4B和7B之外的19條染色體上，可解釋3.74%～11.18%的表型變異，其中在1B染色體上檢測到7個與粒長顯著關聯的標記，在4A、5B、5D和7D染色體上檢測到4個與粒長顯著關聯的標記，在1A、2B、3D、5A和6D染色體上檢測到3個與粒長顯著關聯的標記，說明這些染色體對粒長影響較大，尤其是1B染色體，可作為研究粒長性狀重要的染色體，另外位于1B染色體上的AX-110525847、1D染色體上的AX-94745216、3B染色體上的AX-111464452、7A染色體上的AX-108802871和AX-111664463在所有環境下均被檢測到，可作為后續研究粒長性狀的重要標記。檢測到7個與粒寬顯著關聯的標記，它們分布在1B、2B、4B、5B、5D、6B和7B染色體上，可解釋 3.79%～7.74%的表型變異(圖1和表2)。

表1 春小麥籽粒性狀表型變異Table 1 Grain phenotypic variation in spring wheat

圖1 春小麥籽粒性狀Q-Q圖和曼哈頓圖

續圖1 春小麥籽粒性狀Q-Q圖和曼哈頓圖

在1B染色體637.98～643.18 Mb的區間檢測到與千粒重、粒長和粒寬顯著關聯的標記位點；在2B染色體11.30～11.90 Mb的區間檢測到與粒長和粒寬顯著關聯的標記位點；在3B染色體720.17～725.28 Mb的區間檢測到與千粒重和粒長顯著關聯的標記位點；在4B染色體596.35 Mb處檢測到同時與千粒重和粒寬顯著關聯的標記位點；在5A染色體511.90～518.31 Mb的區間檢測到與千粒重和粒長顯著關聯的標記位點；在5D染色體384.77～390.26 Mb的區間檢測到與粒長和粒寬顯著關聯的位點標記(表2)。這說明B染色體組在小麥籽粒形成過程中發揮著重要的調控作用，這些染色體區段可作為后續研究的重點內容。

表2 與春小麥籽粒性狀顯著關聯的SNP標記Table 2 SNP marker significantly associated with grain traits in spring wheat

(續表2 Continued table 2)

2.3 小麥籽粒性狀候選基因的功能預測

將與小麥籽粒性狀穩定關聯的SNP標記的延伸序列在中國春基因組數據庫中進行搜索，獲取基因序列，并在NCBI數據庫中進行BLASTx，共獲得6個與籽粒性狀相關的候選基因(表3)，它們分別編碼含NB-ARC域的抗性蛋白、胚芽蛋白樣蛋白、RING/U-box超家族蛋白、晚期胚胎發生豐富蛋白、O-甲基轉移酶和含有LRR和NB -ARC域的抗病蛋白。

表3 篩選到的與小麥籽粒性狀相關的候選基因Table 3 Candidate genes screened potentially related to wheat grain traits

3 討 論

3.1 春小麥籽粒性狀的表型變異

小麥是中國主要糧食作物之一，小麥籽粒相關性狀的遺傳解析對提高中國小麥產量具有重要意義。本研究通過對298份春小麥品種在5個環境下籽粒性狀(千粒重、粒長和粒寬)的表型變異進行分析，發現不同環境下，新疆育成品種的3個籽粒性狀的平均值均高于國外引進品種和新疆地方品種；新疆地方品種的3個籽粒性狀的平均值最低。馬艷明等研究也表明，新疆冬小麥育成品種的千粒重、粒長和粒寬普遍高于地方品種。其原因可能是當地小麥地方品種的產量潛力有限，導致小麥籽粒的大小和千粒重成為新疆育種家關注的重要性狀。本研究還發現，新疆春小麥品種籽粒性狀變異較大，遺傳背景豐富，且遺傳力較大，比較容易挖掘出調控小麥籽粒性狀的優異候選基因，從而對現有的春小麥品種進行遺傳改良，進一步提高新疆小麥的產量。

3.2 春小麥籽粒性狀的全基因組關聯分析(GWAS)

小麥籽粒性狀是受多基因控制的數量性狀，GWAS是研究與目標性狀相關的分子標記、挖掘相關功能基因常用的方法之一。本研究在1A染色體11.57～30.14 Mb的區間內發現3個與小麥粒長顯著關聯的標記，Li等也在這一區間發現了與小麥籽寬顯著關聯的標記，說明這一區間可能存在調控小麥籽粒形成的重要基因。翟俊鵬等在1B染色體652.58 Mb處發現的與抽穗期顯著關聯的標記與本研究在637.98～643.18 Mb區間發現的與千粒重、粒長和粒寬顯著關聯的標記距離9.40～14.60 Mb，雖然距離超出LD衰減距離，但是距離較近，推測這兩個位點可能為同一位點，此位點可能為新發現的控制小麥籽粒性狀的穩定的一因多效位點；本研究在5B染色體18.52 Mb處發現的與粒長顯著關聯的標記與翟俊鵬等發現的與穗粒數顯著關聯的標記距離為8.08 Mb，Sun等也在5B染色體 10.88處發現了與粒長關聯的標記，根據本研究衰減距離為8 Mb，可將這幾個標記位點看作為同一位點。這些不同研究中得到的相同或相近位點，具有較高的可靠性，可以為輔助育種的分子標記開發提供參考，同時對于進一步發掘候選基因具有重要價值。

本研究在1A染色體468.73～488.65 Mb的區間檢測到與千粒重顯著關聯的標記，與Li等發現的標記在染色體上的距離為28.53～34.63 Mb，說明這兩個標記位點不是同一位點；與張 芳等在1A染色體473.7 Mb處發現的調控小麥粒長和籽粒周長的標記距離僅為4.97 Mb，可能為同一位點。本研究在1A染色體 535.43～ 536.44 Mb的區間也檢測到與千粒重顯著關聯的標記，與翟俊鵬等在1A染色體519.47 Mb處發現的與株高顯著關聯的標記距離為 15.96～16.97 Mb，這與本研究發現的標記位點不是同一位點，推測本研究發現的標記位點為新位點。本研究在3B染色體720.17～725.28 Mb的區間檢測到與粒長和千粒重顯著關聯的標記，在4B染色體596.35 Mb處檢測到同時與粒寬和千粒重顯著關聯的標記，但這些標記位點均未見報道，推測這些標記位點可能是控制小麥籽粒性狀的新位點。這些新發現的SNP標記位點為解析小麥籽粒性狀的遺傳基礎提供了新的研究方向，同時為進一步挖掘調控小麥籽粒性狀的基因奠定了基礎，但還需要進一步驗證這些標記位點的穩定性、可靠性和多效性。

3.3 候選基因分析

將與小麥籽粒性狀顯著關聯的穩定SNP標記序列在NCBI數據庫中進行BLASTx，共得到6個與小麥籽粒性狀相關的候選基因。其中，位于3B染色體上的TraesCS3B01G473700編碼RING/U-box超家族蛋白，該家族蛋白在泛素通路中起作用，可調節種子和器官大小。位于4B染色體上的TraesCS4B01G332700編碼晚期胚胎發生豐富蛋白，該蛋白在籽粒干燥耐受性中起重要作用，推測其通過調控籽粒干燥過程中的耐受性來影響籽粒的最終形成。位于6A染色體上的TraesCS6A01G389900編碼O-甲基轉移酶，該酶在細胞間起黏附作用，推測其通過調控籽粒內細胞間的黏附程度影響籽粒的重量、大小、形狀等性狀的形成。

4 結 論

本研究通過對298份春小麥品種3年共5個環境的3個主要籽粒性狀結合55 K SNP基因芯片進行GWAS，共得到84個顯著關聯的穩定SNP標記，并在1A染色體上檢測到2個與小麥千粒重顯著關聯的新標記位點，在1B染色體上檢測到1個與小麥千粒重、粒長和粒寬顯著的新標記位點，在3B染色體上檢測到1個與小麥粒長和千粒重顯著的新標記位點，在4B染色體上檢測到1個與小麥粒寬和千粒重相關的新標記位點。經篩選獲得6個可能調控小麥籽粒性狀的候選基因，這些候選基因可能通過調控小麥機體生理活動、有機物合成、蛋白活性等影響小麥籽粒性狀的最終形成。

致謝：本研究在試驗進行和論文撰寫過程得到西北農林科技大學許盛寶教授的大力支持，特此致謝！