SORL1基因多態(tài)性與阿爾茨海默病的相關(guān)性研究

包瑞婷， 戴莉莉， 周 濤， 吐瑪熱斯·塔外庫力， 宋雨影， 卡力比努爾·賽買提， 哈斯也提·依不來音

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種復(fù)雜的、多因素的神經(jīng)退行性疾病[1]，是導(dǎo)致老年人癡呆的主要原因，該病給患者、照顧者和社會(huì)帶來了巨大的負(fù)擔(dān)，隨著人類預(yù)期壽命不斷的延長，AD的發(fā)病率和患病率不斷增加，這些事實(shí)突出了阿爾茨海默病成為未來國民主要健康負(fù)擔(dān)的可能性，并強(qiáng)調(diào)了確定該病主要危險(xiǎn)因素的必要性及確定診斷、治療和預(yù)防目標(biāo)的迫切性。AD大腦中表現(xiàn)出廣泛的病理變化，包括神經(jīng)元丟失以及細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)中異常磷酸化的tau蛋白和細(xì)胞外由β淀粉樣肽(Aβ)組成的神經(jīng)炎斑塊的積累，[2]血管異常[3]等。目前關(guān)于AD的治療也集中在其神經(jīng)病理特征[4]。為了調(diào)查潛在的阿爾茨海默病的遺傳風(fēng)險(xiǎn)，大規(guī)模全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)、候選基因研究和通路分析已經(jīng)被廣泛地進(jìn)行[5]，自20世紀(jì)90年代初以來，分子遺傳學(xué)研究已證實(shí)目前已有數(shù)百種基因與阿爾茨海默病的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)[6]。2004年 Scherzer等首次發(fā)現(xiàn)了山梨素相關(guān)受體1(SORL1)基因是與AD發(fā)生相關(guān)的候選基因后[7]，SORL1基因作為LOAD的易感基因于2007年開始被廣泛研究[8]。目前已有大量研究證實(shí)SORL1與AD患病風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)。SORL1是一種神經(jīng)元載脂蛋白E受體，主要表達(dá)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，近年來，SORL1的異常表達(dá)被認(rèn)為只要與AD的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[9]。因此研究SORL1基因變異對阿爾茨海默病發(fā)生發(fā)展的預(yù)測價(jià)值可能有助于更好的預(yù)防和治療AD，目前有關(guān)SORL1基因多態(tài)性與AD相關(guān)性的探索已在很多種族、民族之間進(jìn)行，但由于阿爾茨海默病是由遺傳和環(huán)境因素共同作用引起，SORL1基因變異與AD的相關(guān)性在不同研究中的結(jié)果并不完全一致，所以，我們檢測了來自新疆地區(qū)阿爾茨海默病患者及健康對照者SORL1的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)，以確定這些基因座的基因型和等位基因頻率與新疆地區(qū)AD發(fā)病的相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果將為闡明AD的發(fā)病機(jī)制和尋找新的治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象 我們選取在2016年8月-2018年6月期間就診于新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院和烏魯木齊市周邊醫(yī)院的131例阿爾茨海默病患者作為本研究的病例組。病例組患者年齡均≥65歲，平均(74.40±7.921)歲，其中男性61例、女性70例，維吾爾族72例，漢族59例，均為散發(fā)性阿爾茨海默病患者。同時(shí)間在新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院體檢的健康人群中選取與病例組在年齡、性別、生活環(huán)境及方式、學(xué)歷等方面相類似的非AD患者或健康志愿者128例作為對照組，年齡均≥65歲，平均年齡(75.20±7.857)，其中男性53例、女性75例，維吾爾族63例，漢族65例。并對兩組受試者的性別、年齡、學(xué)歷方面進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表1)。

表1 AD組與對照組一般特征比較

本研究為病例對照研究，所有研究對象均簽署知情同意書，通過新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本收集 對所有受試者均采集清晨空腹肘靜脈血3ml，使用抗凝劑后保存于-80 ℃冰箱，分批進(jìn)行DNA提取。

1.2.2 基因組DNA的提取 用全血提取基因組DNA：將加用抗凝劑低溫保存的血液放置室溫下解凍，購買并使用TIANamp Genomic DNA kit提取試劑盒(北京天根生物技術(shù)公司)，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行DNA提取，所有樣品提取DNA后，測定DNA濃度和純度。

1.2.3 目的基因測定 在公共數(shù)據(jù)庫NCBI(http：//www. ncbi. nlm. nih. gov/projects/SNP/)上查詢并記錄SORL1基因SNP基因座的標(biāo)準(zhǔn)序列，其位點(diǎn)序列號rs1010159、rs2282649、rs3824968、rs1699102、rs3781836、rs2070045、rs3781834、rs641120、rs689021、rs668387、rs12364988、rs985421。采用Primer Premier5．0軟件設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)選用的SNP位點(diǎn)的KASP引物(見表2)，采用PCR擴(kuò)增技術(shù)及DNA測序檢測方法SORL1基因。委托北京博淼生物科技有限公司通過連接酶檢測-聚合酶鏈反應(yīng)(LDR—PCR)方法對SORL1基因多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。

表2 SORL1基因多態(tài)性位點(diǎn)引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

1.3.1 實(shí)驗(yàn)為病例對照，年齡為計(jì)量資料，若符合正態(tài)分布，兩組比較采用t檢驗(yàn)，若不符合正態(tài)，數(shù)據(jù)用中位數(shù)±四分位間距表示，采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。性別及文化程度為計(jì)數(shù)資料，采用χ2檢驗(yàn)。

1.3.2 H-W吻合度檢測采用Hardy-Weinberg均衡檢驗(yàn)確定群體代表性。檢測結(jié)果表示，SORL1基因型及等位基因的觀望值和期望值之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表3)。

1.3.3 基因頻率和基因型的分布采用基因計(jì)數(shù)法，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率(%)表示，采用SPSS26.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間相互比較采用χ2檢驗(yàn)和(或)Fisher精確概率法。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SORL1基因rs1010159、rs2282649、rs3824968、rs1699102、rs3781836、rs2070045、rs3781834、rs641120、rs689021、rs668387、rs12364988、rs985421位點(diǎn)多態(tài)性比較結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)中SORL1基因目標(biāo)位點(diǎn)的基因型及等位基因檢測結(jié)果符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)(見表3)。

表3 Hardy-Weinberg遺傳平衡吻合度檢驗(yàn)結(jié)果[n(%)]

2.2 病例組與對照組SORL1基因rs1010159、rs2282649、rs3824968、rs1699102、rs3781836、rs2070045、rs3781834、rs641120、rs689021、rs668387、rs12364988、rs985421位點(diǎn)的基因型及等位基因分布的比較 由表4可見，本實(shí)驗(yàn)所選中的SORL1基因中的各個(gè)位點(diǎn)的基因型及等位基因的分布在AD組與對照組中相比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明SORL1基因rs1010159、rs2282649、rs3824968、rs1699102、rs3781836、rs2070045、rs3781834、rs641120、rs689021、rs668387、rs12364988、rs985421位點(diǎn)多態(tài)性與AD無關(guān)(P>0.05)。

表4 病例組與對照組基因位點(diǎn)基因型及等位基因頻率比較[n(%)]

2.3 AD患者SORL1基因rs1010159、rs2282649、rs3824968、rs1699102、rs3781836、rs2070045、rs3781834、rs641120、rs689021、rs668387、rs12364988、rs985421位點(diǎn)等位基因分布情況 散點(diǎn)圖是根據(jù)DNA產(chǎn)物峰面積大小計(jì)算得到SNP位點(diǎn)所有分型點(diǎn)狀圖，本實(shí)驗(yàn)所有位點(diǎn)等位基因正常聚類圖中2個(gè)純合子分型根據(jù)產(chǎn)物峰高分別在聚類在靠近橫、縱軸附近，在二者之間單獨(dú)聚類的一組為雜合子(見圖1)。根據(jù)散點(diǎn)圖可見聚類良好。

注：No Call 未發(fā)現(xiàn)等位基因的病例個(gè)數(shù)

3 討 論

在人類中，神經(jīng)元山梨素相關(guān)受體(SORL1，又稱SorLA或LR11)位于染色體11q23.2-q24.2的長臂上，全長177.49 kb，編碼一個(gè)250 kD的膜蛋白，在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元中均有表達(dá)，參與了物質(zhì)在膜和細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞器之間的細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸[10]。目前研究已證明SORL1基因變異可明顯增加晚發(fā)型阿爾茲海默病的患病風(fēng)險(xiǎn)。主要原因是研究發(fā)現(xiàn)在晚發(fā)型阿爾茨海默病患者腦組織中發(fā)現(xiàn)SORL1表達(dá)明顯降低[11]、SORL1的表達(dá)減少與淀粉樣多肽的產(chǎn)生增加有關(guān)、SORL1基因多態(tài)性與AD特異性腦結(jié)構(gòu)(即海馬和海馬旁回)的萎縮有關(guān)[12]、SORL1缺陷神經(jīng)元中Aβ多肽的增加，Aβ多肽的增加的原因可能部分是由于Aβ或APP由高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體的減少所致[13]。SORL1編碼的蛋白質(zhì)(SORLA)已被證明與老年斑的主要成分淀粉樣蛋白-β的加工、運(yùn)輸和降解有關(guān)。SORL1還是載脂蛋白E/低密度脂蛋白受體家族的成員，具有分類和運(yùn)輸?shù)鞍椎墓δ埽龑?dǎo)β-APP進(jìn)入循環(huán)內(nèi)體途徑，導(dǎo)致AD老年斑的主要成分Aβ的產(chǎn)生。但SORL1的上述致病作用在不同人群的實(shí)驗(yàn)中的相關(guān)性不盡相同，可能原因是人群差異，或是生活環(huán)境差異，亦或是因?yàn)樯鲜鲎饔迷诓煌巳褐械挠绊懖煌承┤巳褐谐尸F(xiàn)為致病性，而某些人群中影響不足以致病，我們稱之為因果影響與修飾影響。

Cong等的一項(xiàng)meta分析表示，亞洲人群中單核苷酸多態(tài)性(rs1010159、rs641120)與阿爾茨海默病易感性之間的風(fēng)險(xiǎn)增加[14]。Ning等對144例中國LOAD患者和476例健康對照SORL1的6個(gè)SNPs(rs2070045，rs661057，rs668387，rs689021，rs3824968，rs2282649)進(jìn)行了基因分型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SORL1中的3個(gè)SNPs rs2070045、rs3824968和rs2282649與樣本中的LOAD顯著相關(guān)[15]，其余3個(gè)SNPs rs661057，rs668387，rs689021與樣本中的LOAD無關(guān)。Xue等為探討SORL1 SNP rs2070045單核苷酸多態(tài)性(SNP)與LOAD的關(guān)系，對77例LOAD患者和100例對照人群進(jìn)行病例對照研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)T等位基因攜帶者患AD的危險(xiǎn)性顯著高于對照組(OR=2.616，χ2=6.627，P=0.010)[16]。Liu等通過調(diào)查了在歐洲EOAD中發(fā)現(xiàn)的這11種SORL1變體，以及在歐洲祖先中的個(gè)體在大規(guī)模的EOAD和GWA中的負(fù)荷風(fēng)險(xiǎn)，發(fā)現(xiàn)rs2070045、rs1699102和rs3824968這三個(gè)基因變體可以顯著調(diào)節(jié)人腦組織中SORL1的表達(dá)[17]。Wen等在日本對583例神經(jīng)病理學(xué)特征的腦供體受試者(見表1)的SORL1基因的19個(gè)SNPs進(jìn)行了基因分型，通過基于SNP的病例對照關(guān)聯(lián)研究和多元Logistic回歸分析，發(fā)現(xiàn)19個(gè)SNP基因型中有5個(gè)與LOAD有關(guān)：rs12364988，rs985421，rs4598682，rs3781834，rs3781836[18]。荷蘭研究者在研究鹿特丹市研究的6741例參與者和伊拉斯謨魯芬家族研究的2883例個(gè)體中測試了與阿爾茨海默病和認(rèn)知功能的關(guān)聯(lián)，未能發(fā)現(xiàn)SORL1基因與AD事件之間的關(guān)聯(lián)[19]。目前SORL1基因多態(tài)性與AD之間的相關(guān)性的研究已在多國多民族間進(jìn)行了復(fù)制研究，我們無法將研究結(jié)果一一例舉，但通過相似的研究方法得出不同的研究而言，科學(xué)家們相信阿爾茨海默病是一種遺傳上的異質(zhì)性和復(fù)雜性疾病，這種差異可能是由于不同種族、不同群體、不同地區(qū)間遺傳異質(zhì)性的影響，也可能是其他遺傳因素和環(huán)境因素協(xié)同作用導(dǎo)致的樣本的差異。

在我們的實(shí)驗(yàn)研究中，我們對SORL1基因rs1010159、rs2282649、rs3824968、rs1699102、rs3781836、rs2070045、rs3781834、rs641120、rs689021、rs668387、rs12364988、rs985421位點(diǎn)的基因型及等位基因進(jìn)行分組評估，結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。目前有關(guān)新疆地區(qū)的研究已有2例，張玉潔等的研究發(fā)現(xiàn)SORL1基因2070045、rs3824968位點(diǎn)可能與新疆哈薩克族及漢族SAD無相關(guān)性[20]。另一例本實(shí)驗(yàn)組研究結(jié)果所得，對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行民族間分組討論，認(rèn)為SORL1基因rs378183、6rs3781834位點(diǎn)多態(tài)性與新疆漢族AD與維吾爾族AD無關(guān)[21]。由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們無法斷定SORL1基因變異在新建人群不導(dǎo)致AD的發(fā)生，因?yàn)樾陆且粋€(gè)多民族聚居的地區(qū)，生活在這里的民族有47個(gè)，且地廣人稀，我們的實(shí)驗(yàn)入組對象民族成分單一，僅包含了維吾爾族與漢族，我們實(shí)驗(yàn)對象的來源也單一，僅收集了烏魯木齊市及周邊少數(shù)地區(qū)的病例。考慮到以上幾點(diǎn)，我們認(rèn)為我們樣本的代表性不足以證明整個(gè)新疆地區(qū)，我們無法否認(rèn)SORL1基因與AD之間的關(guān)聯(lián)性。因此我認(rèn)為在新疆仍需要大樣本、多中心、跨民族、跨區(qū)域的研究來證明SORL1基因與AD的關(guān)聯(lián)性。

綜上所述，我們的研究沒有發(fā)現(xiàn)SORL1基因rs1010159、rs2282649、rs3824968、rs1699102、rs3781836、rs2070045、rs3781834、rs641120、rs689021、rs668387、rs12364988、rs985421位點(diǎn)的多態(tài)性與AD相關(guān)，導(dǎo)致該結(jié)果的原因可能是(1)樣本量小、納入民族單一、涵蓋地域單一，希望未來能有大樣本、多中心的研究。(2)AD是一種遺傳上和環(huán)境上具有異質(zhì)性和復(fù)雜性的疾病，不能用單一的因素解釋其相關(guān)性。