復(fù)方甘菊利多卡因凝膠對(duì)大鼠皮膚創(chuàng)面愈合的影響

謝振年, 安曉靜, 周海洋, 王芳麗, 王立平

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院, 1. 肛腸外科, 2. 病理科, 北京, 100091;. 中國(guó)人民解放軍空軍特色醫(yī)學(xué)中心 普外科, 北京, 100142;4. 航天中心醫(yī)院 普外科, 北京, 100049; 5. 北京豐益肛腸醫(yī)院, 北京, 100000)

創(chuàng)面修復(fù)包括機(jī)體自身組織的再生、修復(fù)、重建以及后期的人為干預(yù)，影響因素較多，易引發(fā)局部和全身感染[1]。創(chuàng)面的愈合，尤其是外科術(shù)后的創(chuàng)面修復(fù)一直是困擾臨床醫(yī)生的難題。復(fù)方甘菊利多卡因凝膠(簡(jiǎn)稱甘美達(dá)凝膠)的主要成分為鹽酸利多卡因和洋甘菊花酊，其對(duì)口腔炎癥與疼痛具有顯著的療效，但關(guān)于其在外科手術(shù)創(chuàng)面愈合中作用的研究仍較少[2-5]。本研究建立皮膚創(chuàng)面大鼠動(dòng)物模型，觀察甘美達(dá)凝膠對(duì)創(chuàng)面修復(fù)的效果，并探討其作用機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

SD大鼠18只[北京華阜康生物科技股份有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(京)2019-0008], 體質(zhì)量180～220 g, 性別相同。飼養(yǎng)條件為自由進(jìn)食和飲水，室溫20 ℃, 相對(duì)濕度約50 ℃。皮膚創(chuàng)面模型建成后，將18只大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(甘美達(dá)凝膠)、陽(yáng)性藥組(多黏菌素B)和模型組(生理鹽水沖洗)。治療時(shí)間觀察點(diǎn)分別為治療7、14 d時(shí), 7 d時(shí)每組為6只, 14 d時(shí)每組為3只。

1.2 主要藥物及試劑

復(fù)方甘菊利多卡因凝膠(Kamistad, STADA Consumer Health Deutschland GmbH), 復(fù)方多黏菌素B軟膏(孚諾，浙江孚諾醫(yī)藥股份有限公司)，生理鹽水。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒(Fankew, Shanghai FANKEL Industrial Co.,Ltd)。

1.3 建立皮膚創(chuàng)面模型

采用10%水合氯醛對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，劑量為30 mg/kg。將大鼠背部脫毛消毒，備皮面積為2 cm×2 cm。將大鼠麻醉后固定于手術(shù)臺(tái)上，在背部脊柱一側(cè)頭尾兩端平行于脊柱標(biāo)記1個(gè)圓形切口，用手術(shù)刀沿標(biāo)記線切除全層皮膚至深筋膜，形成創(chuàng)面。

1.4 治療過(guò)程

創(chuàng)面模型形成后，實(shí)驗(yàn)組、陽(yáng)性藥組和模型組分別在局部涂抹藥物，每天2次。模型組采用生理鹽水沖洗潰瘍面。分別在治療1、7、14 d時(shí)記錄創(chuàng)面愈合情況，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量潰瘍直徑。

1.5 觀察指標(biāo)

分別于治療7、14 d時(shí)將各組大鼠脫頸處死，切除潰瘍組織，分為2塊，其中一塊置于-80 ℃冰箱凍存，留待TNF-α、IL-6和IL-1β檢測(cè)使用; 另一塊放入10%甲醛溶液中固定24 h, 行常規(guī)脫水、包埋、切片，采用蘇木精-伊紅染色(HE染色)觀察創(chuàng)面的組織病理變化和免疫組織化學(xué)染色結(jié)果。采用ELISA試劑盒檢測(cè)創(chuàng)面組織中TNF-α、IL-6和IL-1β的含量，方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠治療7、14 d時(shí)創(chuàng)面愈合情況

各組大鼠建模時(shí)潰瘍面積基本一致(圖1)。治療7 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組、陽(yáng)性藥組創(chuàng)面均較模型組縮小，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); 治療14 d時(shí)，陽(yáng)性藥組創(chuàng)面仍大于模型組，但差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

圖1 各組大鼠建模時(shí)潰瘍面積比較

表1 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)皮膚創(chuàng)面橫徑比較 cm

2.2 各組大鼠創(chuàng)面的組織形態(tài)學(xué)觀察

治療7 d時(shí)，模型組創(chuàng)面組織中可見(jiàn)明顯的炎性滲出層，肉芽組織水腫，毛細(xì)血管豐富且擴(kuò)張，充血明顯，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn); 與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組、陽(yáng)性藥組炎性滲出層明顯變薄或消失，肉芽組織水腫減輕，毛細(xì)血管密度減少且擴(kuò)張不明顯，炎癥細(xì)胞密度減少，同時(shí)可見(jiàn)較明顯的成纖維細(xì)胞出現(xiàn)。見(jiàn)圖2。

治療14 d時(shí)，模型組創(chuàng)面仍可見(jiàn)少量炎性滲出，但肉芽組織中血管數(shù)量明顯減少，擴(kuò)張不明顯，炎癥細(xì)胞數(shù)量減少，成纖維細(xì)胞增加并可見(jiàn)膠原形成; 與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組血管減少更加明顯且呈閉塞狀態(tài)，炎癥細(xì)胞數(shù)量明顯減少，成纖維細(xì)胞數(shù)量明顯增加，膠原排列有序; 與模型組相比，陽(yáng)性藥組創(chuàng)面有改善，但炎癥細(xì)胞數(shù)量和血管密度仍略多。見(jiàn)圖3。

2.3 各組創(chuàng)面組織中TNF-α、IL-6和IL-1β的表達(dá)

治療7 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組大鼠創(chuàng)面組織中TNF-α、IL-6和IL-1β的表達(dá)水平均低于模型組、陽(yáng)性藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。治療14 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組大鼠創(chuàng)面組織中TNF-α、IL-6和IL-1β的表達(dá)水平仍低于模型組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

A、D: 模型組創(chuàng)面組織形態(tài)學(xué)可見(jiàn)較厚的炎性滲出層,肉芽組織中血管豐富,炎癥細(xì)胞密度較大; B、E: 實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面組織形態(tài)學(xué)可見(jiàn)炎性滲出層較薄,肉芽組織中血管減少,炎癥細(xì)胞密度降低,成纖維細(xì)胞增多; C、F: 陽(yáng)性藥組創(chuàng)面組織形態(tài)學(xué)可見(jiàn)肉芽組織的成熟度低于實(shí)驗(yàn)組。A、B、C放大倍數(shù)為40倍, D、E、F放大倍數(shù)為400倍。圖2 治療7 d時(shí)各組大鼠創(chuàng)面的組織形態(tài)學(xué)HE染色情況

A、D: 模型組創(chuàng)面組織形態(tài)學(xué)可見(jiàn)肉芽組織中血管狹長(zhǎng),炎癥細(xì)胞密度降低,成纖維細(xì)胞和膠原出現(xiàn); B、E: 實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面組織形態(tài)學(xué)可見(jiàn)血管數(shù)量明顯減少,成纖維細(xì)胞核膠原較模型組增多; C、F: 陽(yáng)性藥組創(chuàng)面組織形態(tài)學(xué)可見(jiàn)肉芽組織成熟度低于實(shí)驗(yàn)組。A、B、C放大倍數(shù)為40倍,D、E、F放大倍數(shù)為400倍。圖3 治療14 d時(shí)各組大鼠創(chuàng)面的組織形態(tài)學(xué)HE染色情況

表2 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)創(chuàng)面組織中TNF-α、IL-6和IL-1β的表達(dá) ng/mg

2.4 各組創(chuàng)面組織中膠原含量的苦味酸-天狼猩紅染色情況

采用苦味酸-天狼猩紅染色分析創(chuàng)面組織中膠原含量的變化，治療7、14 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面組織中的膠原含量均高于模型組，且膠原較為粗大，見(jiàn)圖4。

圖4 各組治療7、14 d時(shí)創(chuàng)面組織中膠原含量的苦味酸-天狼猩紅染色比較(偏振光觀察,放大倍數(shù)100倍)

2.5 各組創(chuàng)面組織的免疫組織化學(xué)染色情況

本研究以灰度值表示免疫組化的表達(dá), CCR7/CD68表示經(jīng)典活化(M1)型巨噬細(xì)胞的比例, CD163/CD68表示替代活化(M2)型巨噬細(xì)胞的比例，結(jié)果以累積光密度(IOD)表示。結(jié)果顯示，治療7、14 d時(shí)，各組M1型和M2型巨噬細(xì)胞的比例差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)創(chuàng)面組織中CCR7/CD68和CD163/CD68的表達(dá) IOD

3 討 論

皮膚創(chuàng)面的愈合一般需要經(jīng)過(guò)凝血期、炎癥期、增殖期和重塑期。在創(chuàng)面形成初期，毛細(xì)血管內(nèi)的血液流入創(chuàng)面，與其他生物學(xué)分子形成凝血塊覆蓋于創(chuàng)面表面; 炎癥期時(shí)，中性粒細(xì)胞在創(chuàng)面聚集并開(kāi)始吞噬病原體等微生物，發(fā)揮清除作用; 在損傷后48～72 h, 巨噬細(xì)胞開(kāi)始發(fā)揮吞噬功能，隨著創(chuàng)面愈合的過(guò)程，巨噬細(xì)胞的表型也發(fā)生相應(yīng)的改變，為成纖維細(xì)胞提供大量的生物因子; 在創(chuàng)傷后72 h, 炎癥因子也會(huì)被招募至創(chuàng)面發(fā)揮相應(yīng)的作用，伴隨大量肉芽組織形成，成纖維細(xì)胞開(kāi)始遷移，膠原逐漸增多[6]。

肛腸疾病手術(shù)后病原微生物的控制尤為重要，這是因?yàn)楦啬c術(shù)后的創(chuàng)面多為開(kāi)放性創(chuàng)面，加之糞便的殘留和刺激，極易受細(xì)菌感染，導(dǎo)致傷口愈合緩慢。目前，促進(jìn)創(chuàng)面愈合的方法有很多，包括各種敷料、組織工程皮膚、生長(zhǎng)因子、干細(xì)胞治療、天然藥物和復(fù)方藥物等，其中綜合應(yīng)用多種方法是臨床常用的選擇。甘美達(dá)凝膠是一種復(fù)方外用凝膠，其主要成分為洋甘菊花酊、鹽酸利多卡因。洋甘菊花酊是甘美達(dá)凝膠的主要成分，具有抗炎、促進(jìn)傷口愈合的作用，已被證實(shí)對(duì)多種細(xì)菌，尤其是金黃色葡萄球菌具有明顯的抑制作用[7-8]; 鹽酸利多卡因的主要作用是阻斷痛覺(jué)傳入的產(chǎn)生和傳導(dǎo)，具有快速的止痛作用，且局部應(yīng)用不影響手術(shù)創(chuàng)面愈合[9]。本實(shí)驗(yàn)以大鼠皮膚創(chuàng)面模型為研究對(duì)象，治療7、14 d時(shí)，病理形態(tài)學(xué)顯示采用甘美達(dá)凝膠的實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面炎性滲出層消退時(shí)間提前，肉芽組織更早進(jìn)入成熟期，膠原含量也明顯增多; 創(chuàng)面縮小的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義可能與觀察時(shí)間偏短有關(guān)。

TNF-α是一種促炎癥細(xì)胞因子，主要參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)，可以激活中性粒細(xì)胞，增強(qiáng)其吞噬能力，也可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞的活化[10]。IL-6和IL-1β也是重要的促炎癥介質(zhì)，在全身性感染的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，是啟動(dòng)炎癥反應(yīng)的因子，可以觸發(fā)炎性反應(yīng)瀑布效應(yīng)[11]。研究[12]表明，炎癥因子含量過(guò)高不僅可以導(dǎo)致潰瘍組織的炎癥反應(yīng)，還會(huì)抑制創(chuàng)面的愈合，降低炎癥因子的水平，進(jìn)而促進(jìn)潰瘍的愈合。本實(shí)驗(yàn)采用ELISA法檢測(cè)不同時(shí)點(diǎn)創(chuàng)面組織中炎癥因子的含量，在用藥7 d時(shí)，采用甘美達(dá)凝膠的實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面組織中炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β均較模型組顯著降低，但在用藥14 d時(shí)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明甘美達(dá)凝膠在創(chuàng)面早期抗炎治療中可以發(fā)揮重要的作用，可以促使肉芽組織更趨于成熟，推測(cè)可能與炎癥因子水平的控制有關(guān)。

巨噬細(xì)胞是由外周血中的單核細(xì)胞分化而來(lái)，是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，具有吞噬、殺傷病原微生物的功能，也可以分泌炎性因子或細(xì)胞因子來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)，參與組織的修復(fù)[13-14]。在不同的微環(huán)境中，巨噬細(xì)胞可以分化為M1型和M2型, M1型主要發(fā)揮抗原提呈、吞噬殺滅病原微生物的作用, M2型則可抑制局部炎癥反應(yīng)，促進(jìn)組織的再生修復(fù)和創(chuàng)面的愈合[15]。有研究[16]認(rèn)為巨噬細(xì)胞可以促進(jìn)創(chuàng)面愈合，也有研究[17]認(rèn)為巨噬細(xì)胞只是引發(fā)了炎癥反應(yīng)，并不利于創(chuàng)面愈合。本研究結(jié)果顯示，在創(chuàng)面形成后7、14 d, 各組創(chuàng)面組織中的巨噬細(xì)胞數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表型也無(wú)明顯變化。

綜上所述，甘美達(dá)凝膠對(duì)皮膚創(chuàng)面具有較好的抗炎和促進(jìn)愈合的作用，創(chuàng)傷早期抑制炎癥因子釋放可能是其主要作用機(jī)制之一。