間充質干細胞來源的外泌體中miR-143-3p抑制自噬并逆轉心肌缺血再灌注損傷的機制研究

胡珍艷, 尕永梅, 麥迪乃姆·努爾麥麥提

(新疆醫科大學第七附屬醫院 重癥醫學科, 新疆 烏魯木齊, 830028)

隨著中國人口老齡化加劇，心血管疾病發病率逐年升高，缺血性損傷是心血管疾病的主要原因之一。經皮穿刺冠狀動脈介入術已被用于治療缺血性損傷，但因心肌缺血再灌注(I/R)損傷，治療效果仍然不佳[1]。間充質干細胞(MSCs)具有自我更新和多向分化的潛能，已用于多種缺血性疾病的治療[2-3]。外泌體是一種具有脂質雙膜結構的微小囊泡，通過其內活性成分，如微小RNA(miRNA)介導細胞間的信號通信[4]。MSCs分泌的外泌體作為MSCs治療效能的旁分泌介質，與心肌I/R的治療有關。TANG J等[5]研究發現, MSCs來源的外泌體可通過調控細胞程序性死亡保護心肌I/R。miR-143-3p在各種心臟疾病的生理病理過程中發揮關鍵作用，如miR-143-3p可通過靶向側支發芽因子同源物3(SPRY3)促進心肌梗死后心肌纖維化[6]。此外，絞股藍皂甙A通過激活AMPK/Foxo1通路抑制miR-143-3p水平來保護心肌I/R損傷[7]。心肌I/R機制復雜，其中自噬在I/R中發揮重要作用，研究[8]發現miR-143-3p可靶向自噬相關蛋白B(ATG2B)抑制自噬促進深靜脈血栓形成。目前miR-143-3p調控自噬對心肌I/R的影響相關研究較少。本研究通過構建細胞、動物模型探討miR-143-3p通過自噬調控心肌I/R的機制，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物

選取4周齡成年雄性SD大鼠，購自江蘇動物實驗室。所有動物實驗均經過本院動物倫理道德委員會批準。實驗結束后，對大鼠腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥鈉進行安樂死。

1.2 材料

鼠源骨髓MSCs、大鼠心肌細胞H9c2細胞株(ATCC, 美國)。Dulbecco′s modified Eagle′s medium (DMEM, Gibco, 美國)，胎牛血清、雙抗、胰蛋白酶(Sigma公司，美國); 引物序列(上海吉凱生物科技有限公司), miR-143-3p mimic、miR-143-3p inhibitor、miR-143-3p-NC質粒(上海吉瑪制藥技術有限公司), HieffTM外泌體提取試劑盒[翌圣生物科技(上海)股份有限公司], PKH-67(Sigma, 美國)，兔抗人自噬相關蛋白3B-Ⅰ(LC3B-Ⅰ)、自噬相關蛋白3B-Ⅱ (LC3B-Ⅱ)、p62及GAPDH多克隆一抗、鼠抗兔單克隆二抗(Abcam公司，美國); lipofectamine 2000、RNA提取試劑盒、PCR試劑盒(Tarkara公司，日本); TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(天津中奧天元生物公司); SDS-PAGE凝膠電泳及轉移裝置(天津儀器廠)，曝光機(Bio-rad公司，美國); ABI 7900 PCR儀(天津儀器廠)，透射電子顯微鏡(JEM-1-11, 日本)，納米顆粒跟蹤系統(NTA, 廣州市銳博生物科技有限公司)，熒光顯微鏡(Nikon, 美國)，流式細胞儀(BD Biosciences, 美國)。

1.3 方法

1.3.1 MSCs細胞轉染、外泌體提取: MSCs、H9c2細胞采用DMEM培養基(10%胎牛血清、1%青霉素及鏈霉素)培養，放于37 ℃、5%CO2培養箱，隔日換培養基, 3 d胰酶消化傳代。取第3代MSCs用于轉染，使用lipofectamine 2000對MSCs進行轉染miR-143-3p-NC、miR-143-3p mimic, 最終獲得miR-143-3p高表達的MSCs。通過HieffTM快速外泌體提取試劑盒從MSCs中提取外泌體。

1.3.2 外泌體的鑒定: 利用透射電子顯微鏡鑒定納米脂質雙層囊泡。取20 μL樣品滴加到銅網上，磷鎢酸鈉染色30 s, 烘干。NTA觀察顆粒大小和直徑分布。在37 ℃下用外泌體標記親脂性染料PKH-67培養15 min, 10 000轉/min離心30 min, PBS重懸，然后將H9c2細胞與PKH-67標記的外泌體共培養48 h, 熒光顯微鏡觀察攝取情況。

1.3.3 外泌體轉染H9c2細胞: 取傳代3次后的生長狀態良好的H9c2細胞轉移至6孔板中培養，使用lipofectamine 2000對細胞進行轉染，提取各組MSCs外泌體(MSCs-Exos), 隨后將H9c2細胞置于含1%O2、94%N2和5%CO2的厭氧培養箱內4 h, 然后再復氧2 h, 根據轉染物質不同，分為缺氧/復氧(H/R)組(不轉染)、MSC組(加入不轉染的MSCs-Exos)、miR-143-3p-NC組(轉染miR-143-3p-NC)、miR-143-3p mimic組(轉染miR-143-3p mimic)。

1.3.4 自噬雙標腺病毒(mRFP-GFP-LC3)實驗: 將各組H9c2細胞接種在12孔培養板上，培養24 h后使用lipofectamine 2000轉染mRFP-GFP-LC3, 24 h后激光共聚焦觀察細胞自噬流情況。

1.3.5 建立I/R模型及處理: 將25只大鼠隨機分為5組，每組5只。常規麻醉后，在第四肋間打開胸腔，用7-0絲線阻斷左冠狀動脈前降支(不結扎), 40 min后松開絲線，再灌注2 h, 建立I/R模型。① 對照組: 打開胸腔，不處理左冠狀動脈前降支; ② H/R組: 建立I/R模型; ③ MSC組: 松開絲線前5 min, 使用1 mL注射器針頭在損傷區域的前側、外側注射10 μL MSCs無任何處理的外泌體; ④ miR-143-3p mimic組: 松開絲線前5 min, 使用1 mL注射器針頭在損傷區域的前側、外側注射10 μL轉染miR-143-3p的MSCs-Exos; ⑤ miR-143-3p-NC組: 松開絲線前5 min, 使用1 mL注射器針頭在損傷區域的前側、外側注射10 μL轉染miR-143-3p-NC的MSCs-Exos。

1.3.6 大鼠血清生化指標檢測: 大鼠麻醉后經腹主動脈取血，提取血清，采用酶聯免疫反應法測定心肌肌鈣蛋白I(cTnI)、肌酸磷酸激酶(CK)。

1.3.7 2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色: 大鼠行安樂死后立刻摘取心臟組織, -20 ℃放置30 min, 將心肌組織切成1 mm厚的切片, 1% TTC染料37 ℃恒溫箱孵育30 min, PBS洗滌3次, ImageJ軟件分析梗死面積。

1.3.8 脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(TUNEL)染色: 各組心肌組織用10%福爾馬林固定、包埋、切片，滴入20 g/mL無DNA酶蛋白酶K, 37 ℃孵育30 min, PBS洗3次，隨后滴加TUNEL溶液, 37 ℃孵育60 min, PBS洗滌3次。最后加入HRP連接的鏈霉親和素孵育30 min, DAB溶液孵育5～10 min顯色，光學顯微鏡下觀察細胞凋亡情況，凋亡細胞呈綠色。隨機選擇5個視野，計算凋亡細胞數量，凋亡率=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1.3.9 RT-PCR檢測細胞、外泌體中miR-143-3p表達: 向各組細胞或外泌體中加入200 μL Trizol提取總RNA, NANOdrop儀檢測RNA含量，逆轉錄成cDNA, 上機進行PCR擴增，條件為95 ℃下2 min、94 ℃下20 s、58 ℃下20 s、72 ℃下20 s, 共30個循環，結束后構建溶解曲線。采用2-△△Ct法表示LRP6相對含量。內參為U6。miR-143-3p引物: 正向引物5′-GGGGTGAGATGAAGCACTG-3′, 反向引物5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′;U6引物: 正向引物5′- CTCGCTTCGGCAGCACA-3′, 反向引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.3.10 Western blot檢測LC3B-Ⅰ、LC3B-Ⅱ及 p62蛋白表達: 取各組組織加2 mL RIPA液，混勻，冰上放置30 min, 4 ℃下14.0×g離心5 min, 小心將上清轉移至新的EP管中, 100 ℃下煮10 min, 檢測蛋白濃度，加入loading。配10%分離膠、5%濃縮膠，上樣電泳1.5 h, 轉膜, 5%牛奶封閉1 h, LC3B-Ⅰ(1∶1 000)、LC3B-Ⅱ(1∶1 000)、p62(1∶1 000)及GAPDH(1∶1 000)4 ℃過夜, PBS洗3次，相應的二抗室溫1 h, PBS洗3次。Bio-Rad成像儀曝光成像, ImageJ軟件分析灰度值，以目標蛋白與內參條帶比值表示相對表達量。

1.4 統計學分析

2 結 果

2.1 MSCs-Exos的特征

MSCs-Exos 呈典型的圓形(圖1A), 直徑為100～200 nm(圖1B)。Western blot結果顯示, MSCs-Exos中CD63、CD81表達水平高于MSCs(圖1C、1D)。PKH67標記的MSCs-Exos與H9c2細胞共培養后可在細胞質內發現外泌體(圖1E)。

A: MSCs-Exos典型圖像; B: MSCs-Exos直徑分析; C、D: MSCs-Exos中CD63、CD81表達水平; E: 將 H9c2與PKH26標記的MSCs-Exos共培養12、24 h后,通過熒光顯微鏡檢測MSCs-Exos可被內化到H9c2中,免疫熒光檢測PKH26標記的MSCs-Exos吞噬到H9c2細胞。圖1 MSCs-Exos 的鑒定和表征

2.2 MSCs-Exos對H/R誘導的H9c2細胞自噬的影響

免疫熒光結果顯示，H/R組H9c2細胞自噬流高于對照組, MSC組細胞自噬流低于H/R組，差異均有統計學意義(P<0.01)(圖2A、2B)。H/R組細胞LC3B-Ⅱ與LC3B-Ⅰ比值(LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ)高于對照組, p62表達量低于對照組，差異均有統計學意義(P<0.01); MSC組細胞LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ低于H/R組, p62表達量高于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)(圖2C、2D)。

2.3 MSCs-Exos中miR-143-3p表達水平

MSCs-Exos中miR-143-3p表達水平為(1.6±0.2), 高于MSCs中的(0.9±0.1), 差異有統計學意義(P<0.01)。

2.4 各組H9c2細胞miR-143-3p表達

H/R組H9c2細胞miR-143-3p水平為(0.41±0.08), 低于對照組H9c2細胞的(1.04±0.14), 差異有統計學意義(P<0.01); 與H/R組比較, MSC組、miR-143-3p-NC組、miR-143-3p mimic組miR-143-3p水平均升高，依次為(0.73±0.11)、(0.69±0.13)、(1.21±0.34), 差異均有統計學意義(P<0.01); 與miR-143-3p-NC組細胞比較, miR-143-3p mimic組細胞miR-143-3p水平較高，差異有統計學意義(P<0.01)。

2.5 miR-143-3p對大鼠血清cTnI、CK水平的影響

H/R組大鼠血清cTnI、CK水平高于對照組，差異有統計學意義(P<0.01); MSC組大鼠血清cTnI、CK水平低于H/R組，差異有統計學意義(P<0.01); miR-143-3p mimic組大鼠血清cTnI、CK水平低于MSC組、miR-143-3p-NC組，差異有統計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠血清cTnI、CK水平比較

2.6 miR-143-3p對H/R誘導的H9c2細胞自噬的影響

MSC組細胞LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ低于H/R組, p62表達量高于H/R組，差異有統計學意義(P<0.01); miR-143-3p mimic組細胞LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ低于MSC組、miR-143-3p-NC組, p62表達量高于MSC組、miR-143-3p-NC組，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖3。

2.7 miR-143-3p對大鼠心肌細胞自噬的影響

H/R組大鼠心肌組織梗死面積、凋亡率高于對照組，差異有統計學意義(P<0.01); MSC組大鼠心肌組織梗死面積、凋亡率低于H/R組，差異有統計學意義(P<0.01); miR-143-3p mimic組大鼠心肌組織梗死面積、凋亡率低于MSC組、miR-143-3p-NC組，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖4。

A: 各組LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ、p62的Western blot結果; B: 各組相對蛋白表達結果。圖3 miR-143-3p對H/R誘導的H9c2細胞自噬的影響

A: 梗死面積; B: 凋亡情況。圖4 mR-143-3p對大鼠心肌細胞自噬的影響

3 討 論

心肌I/R損傷是指心肌血流停止后再灌注對心肌造成的損傷，可導致心律失常、心肌壞死和心肌收縮功能障礙等各種心肌損傷。I/R機制包括活性氧產物產生、鈣離子超載、過度自噬及炎癥反應，但具體機制尚不清楚[9]。自噬是一種通過溶酶體降解途徑的自我清除過程，在清除死亡細胞的同時，對正常細胞產生損傷。自噬被認為是I/R過程中心肌I/R損傷的重要調節因子。研究[10]報道，在缺血心肌細胞中，自噬通常被過度激活。因此，抑制自噬對治療心肌缺血具有重要的臨床意義。

骨髓MSCs是一類具有多種潛能的干細胞，可通過抗氧化應激、抗炎反應和免疫調節等途徑在抑制I/R損傷中發揮積極的作用[11]。多項研究[12-14]表明，干細胞分泌的外泌體包含多種活性成分，參與了缺血性心臟疾病的治療。本研究結果顯示, I/R心肌細胞高表達自噬相關蛋白，存在高表達自噬流，加入MSCs-Exos后細胞的自噬受到抑制，提示自噬參與了心肌I/R損傷，而MSCs來源的外泌體可減輕自噬。miRNA是一類非編碼RNA，在MSCs-Exos中富集，參與了缺血性心肌的修復。研究[15]稱miR-143-3p具有調節自噬的功能。YEON M等[16]研究發現, miR-143-3p通過降低PC-9/ER細胞自噬流提高抗癌藥物敏感性。LIU K等[17]研究發現, miR-143-3p在心肌梗死細胞中表達下調, LINC00528通過抑制miR-143-3p表達促進心肌梗死的進展。本研究結果顯示, I/R心肌細胞miR-143-3p表達水平顯著下降，通過將miR-143-3p轉染至MSCs提取外泌體，并注射到I/R動物模型，發現其可顯著加強MSCs-Exos對自噬的抑制作用，并改善了心肌損傷。上述研究結果提示, MSCs-Exos可能通過miR-143-3p減輕過度自噬引起的心肌I/R損傷。ZHANG W等[8]研究發現, miR-143-3p可通過靶向ATG2B抑制自噬并促進深靜脈血栓中內皮祖細胞管的形成。CHEN G等[18]研究發現, MSCs源性外泌體miR-143-3p通過靶向CHK2調節自噬抑制心肌I/R損傷，但具體調控機制有待進一步實驗驗證。

綜上所述, I/R損傷的心肌細胞低表達miR-143-3p及過度自噬, MSCs-Exos來源的miR-143-3p可通過抑制自噬保護心肌I/R損傷。本研究結果可能為干細胞外泌體治療缺血性心肌病提供新的方向。