內皮細胞發育調節基因-1在膠原誘導性關節炎中的作用及機制

魏 禺, 徐學鳳, 唐小軍, 梁 軍, 馮學兵, 趙 成

(南京大學醫學院附屬鼓樓醫院 風濕免疫科，江蘇 南京，210008)

類風濕關節炎(RA)是一種復雜的慢性自身免疫性炎癥性疾病[1]。RA可表現為關節毀損和一系列關節外病變，嚴重者可出現殘疾和多器官功能受損。RA的病理特征為滑膜慢性炎癥、滑膜增生和血管翳形成，且目前尚無有效的根治方法[2]。內皮細胞發育調節基因-1(Del-1)是一種52 kDa的基質蛋白，主要由內皮細胞分泌，參與內皮細胞黏附和血管重構調控。研究[3]認為Del-1是機體炎癥反應的重要調控因子。本研究通過構建RA的經典動物模型，探討Del-1對膠原誘導性關節炎(CIA)模型小鼠的作用，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料

健康雌性6周齡DBA/1小鼠21只，購自南京大學模式動物研究所，飼養在南京鼓樓醫院動物房，室溫20 ℃左右，相對濕度50%左右，飼養過程中自由攝食及水。實驗主要試劑: 牛Ⅱ型膠原(美國Sigma公司)、完全弗氏佐劑(美國Sigma公司)、不完全弗氏佐劑(美國Sigma公司)、重組人Del-1(美國R&D公司)、白細胞介素-6(IL-6)和基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)的酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(美國R&D公司)。

1.2 方法

1.2.1 CIA小鼠模型構建及處理: 6周齡DBA/1小鼠，第0天行初次膠原免疫(取牛Ⅱ型膠原與等體積完全弗氏佐劑置于冰上乳化, 1 mL進口螺旋注射器吸取后，在距小鼠尾根部1.5～2.0 cm處皮下注射，每只小鼠100 μL); 第21天行二次膠原免疫(取牛Ⅱ型膠原與等體積不完全弗氏佐劑冰上乳化，距小鼠尾根部1.5～2.0 cm處皮下注射)。正常對照組注射等劑量的PBS緩沖液為對照。造模成功率達80%以上。本實驗將小鼠分為3組，即正常對照組、CIA組和Del-1組(Del-1干預CIA)。第24、31天時, Del-1組分別給予每只小鼠尾靜脈注射Del-1 2 μg/次，共2次。自初始免疫第21天起行關節炎指數(AI)評分，第42天處死小鼠并進行分析。

1.2.2 AI評分標準: 0分為無關節發紅、腫脹; 1分為有紅色斑點或輕度腫脹(限于跗骨或踝關節); 2分為關節紅腫，中度腫脹，腫脹范圍從跗骨延續到踝關節; 3分為關節紅腫，重度腫脹，從跖骨延續到踝關節; 4分為關節紅腫，重度腫脹，從腳趾延續到整個踝關節甚至出現關節強直、活動障礙。總分16分，各個關節的積分累計為每只小鼠的AI值[4]。

1.2.3 關節組織病理學: 第42天處死所有小鼠，對小鼠左踝關節進行甲醛固定、石蠟包埋、切片和蘇木精-伊紅染色(HE染色)，觀察關節局部結構。

1.2.4 血清細胞因子表達: 第42天，經眼球取小鼠血置入1.5 mL EP管中，室溫靜置30 min, 2 000 轉/min離心20 min, 吸取上清，使用ELISA試劑盒檢測IL-6、MMP-9表達情況。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 CIA模型小鼠情況

造模后小鼠體質量增長緩慢，精神不佳，活動量減少，毛發無光澤，自初次免疫后21 d起，逐漸出現小鼠足爪紅腫且逐漸加重。造模成功小鼠足爪明顯紅腫，見圖1。

2.2 CIA組與Del-1組小鼠AI評分比較

CIA組小鼠自初次免疫后第21天起出現關節紅腫, AI評分逐漸增高; Del-1組自初次免疫后第23天起出現關節紅腫, AI評分逐漸增高; 初次免疫后第34、36、38、40天, Del-1組AI評分小于CIA組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠AI評分比較 分

2.3 各組小鼠病理組織學觀察

初次免疫后第42天，對比正常小鼠, HE染色顯示CIA模型小鼠踝關節大量炎癥細胞浸潤、滑膜增生、血管翳形成、軟骨破壞，關節間隙狹窄; Del-1干預后, CIA模型小鼠踝關節炎癥細胞浸潤減少，滑膜增生減輕，軟骨形態尚完整，關節間隙尚清晰。見圖2。

2.4 各組小鼠血清細胞因子表達的比較

初次免疫后第42天, ELISA結果顯示CIA組小鼠血清IL-6、MMP-9表達較正常對照組升高，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01), 而Del-1組小鼠血清IL-6、MMP-9表達較CIA組下降，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

A: 正常DBA/1小鼠; B: CIA模型小鼠; C: Del-1干預CIA模型小鼠。 圖2 各組小鼠踝關節切片的HE染色結果(放大倍數20倍)

A: 各組小鼠血清IL-6水平(與CIA組比較, *P<0.05); B: 各組小鼠血清MMP-9水平(與CIA組比較, *P<0.05, **P<0.01)。

3 討 論

RA是一種復雜的自身免疫性疾病，其發病機制和治療方案仍是目前研究的熱點。CIA模型與人RA在臨床特征、免疫、病理等方面高度相似，是目前RA研究的理想動物模型[5]。本研究采用外源性Del-1干預CIA模型小鼠，發現Del-1能改善關節炎癥狀，證實Del-1能下調CIA模型小鼠IL-6和MMP-9水平。

Del-1是內皮細胞分泌的一種糖蛋白，與內皮細胞或細胞外基質結合，在血管損傷或缺氧情況下，參與血管重建過程。近年來研究[6]發現，基質細胞、巨核細胞系等多種細胞可表達Del-1, 參與慢性炎癥反應和維持機體免疫平衡。Del-1主要含有3個表皮生長因子樣重復序列和2個盤狀結構域樣重復序列，第2個表皮生長因子樣結構域中包含RGD結構域[7]。Del-1結合β2整合素可抑制中性粒細胞和內皮細胞黏附，減少中性粒細胞招募，抑制炎癥啟動。Del-1中RGD結構域特異性結合ανβ3整合素，增強巨噬細胞吞噬作用，參與炎癥消退[8]。研究[3]報道Del-1通過與破骨細胞前體表面Mac-1受體結合來抑制破骨細胞分化。本研究采用二次膠原免疫法誘導DBA/1小鼠為CIA模型小鼠，誘導成功的CIA模型小鼠出現足爪關節紅腫，組織病理學亦發現關節滑膜炎癥浸潤、滑膜增生、骨侵蝕和關節結構破壞等特征。本研究以Del-1干預CIA模型小鼠，結果顯示Del-1能減輕CIA小鼠的關節腫脹，組織病理學研究則發現Del-1能改善CIA小鼠關節炎癥細胞浸潤、滑膜增生、血管翳形成和骨破壞。

IL-6在RA患者外周血和滑液中高表達，是RA發病的關鍵細胞因子[9-10]。IL-6激活免疫細胞、內皮細胞、滑膜細胞、破骨細胞等產生多種細胞因子，參與多種炎癥效應通路調節[11]。IL-6在RA患者中表達升高，與疾病活動和關節骨破壞密切相關，阻斷IL-6表達能改善RA病情。動物研究[12]發現IL-6缺失小鼠不能誘導為CIA模型小鼠, IL-6中和抗體能改善CIA模型小鼠癥狀。臨床試驗[13]提示拮抗IL-6表達能減輕RA患者疾病活動度，改善骨侵蝕。本研究結果發現, CIA模型小鼠血清IL-6表達高于正常小鼠，而Del-1能下調CIA模型小鼠血清IL-6表達，減輕炎癥反應。

本研究還發現Del-1能下調CIA模型小鼠血清異常表達的MMP-9。MMP-9屬于基質金屬蛋白酶(MMPs)家族成員，可以降解細胞外基質成分，是RA軟骨侵蝕、關節破壞的重要細胞因子[14]。rs11908352是MMP-9的一個遺傳變異位點，是RA關節損傷進展的危險因素，并與高水平MMP-9相關，提示MMP-9能預測RA影像學病變進展[15]。本研究結果提示, Del-1能下調CIA模型小鼠血清MMP-9表達，降低CIA小鼠關節炎癥嚴重程度。

綜上所述，慢性持續性炎癥是RA的突出特征，Del-1能改善CIA模型小鼠關節癥狀，減輕炎癥和骨破壞，抑制關鍵細胞因子IL-6和MMP-9的表達，可能在RA治療中發揮一定的作用。