PI3K/AKT/NF-κB信號通路在大鼠尿酸性腎病中的作用機制

隋曉露, 許云鵬, 張燕子, 張艾莎, 謝婷妃, 袁樹珍,鄒杰鋒, 曾啟城, 陳繼紅

(深圳大學第二附屬醫院 腎內科, 廣東 深圳, 518000)

腎間質炎癥和腎間質纖維化是尿酸性腎病的主要病理損害機制，信號通路介導的炎癥損傷機制是其病理損害發生的重要原因。目前，已知多種信號通路在尿酸性腎病的發生發展過程中起重要作用[1]。PI3K/AKT/NF-κB信號通路廣泛參與細胞的凋亡、增殖、分化和遷移等過程。本研究通過“腺嘌呤+乙胺丁醇灌胃”建立尿酸性腎病大鼠動物模型，觀察尿酸性腎病大鼠PI3K/AKT/NF-κB信號通路基因、蛋白和炎性細胞因子表達水平，探討 PI3K/AKT/NF-κB信號通路在尿酸致腎臟細胞炎癥損傷中的調控機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及處理

雄性SD大鼠36只，由南方醫科大學動物實驗中心提供，體質量180～200 g, 恒溫環境下標準化飼養1周。36只大鼠隨機分為實驗組及對照組，每組18只。本研究方案經深圳市寶安區人民醫院倫理委員會倫理審查通過。

實驗組大鼠予腺嘌呤+乙胺丁醇灌胃建立大鼠高尿酸性腎病模型。腺嘌呤 10 g、乙肝丁醇 25 g, 加生理鹽水定容至1 L,-20 ℃分裝保存，使用前恢復至室溫。按腺嘌呤100 mg/kg+乙肝丁醇250 mg/kg, 每日1次灌胃，連用28 d。給藥前、腺嘌呤+乙胺丁醇灌胃28 d時采血，檢測血漿中黃嘌呤氧化酶(XO)、血尿酸(UA)、肌酐(Cr)和尿素氮(BUN), 上述指標顯著高于對照組提示造模成功。對照組給予等量生理鹽水灌胃。

1.2 標本收集及處理

采集頸靜脈血，每次1 mL, 肝素抗凝后提取血漿,-80 ℃保存。實驗結束處死大鼠，摘取雙側腎臟，取部分腎臟觀察腎臟組織病理學改變，剩余腎臟-80 ℃凍存。

1.3 觀察指標及方法

1.3.1 生化指標檢測: 采集新鮮靜脈血，肝素抗凝后提取血漿，檢測血漿中XO、UA、Cr和BUN水平。

1.3.2 腎臟組織病理學: 取各組新鮮腎臟皮質、髓質和皮髓交界處標本，用 10%福爾馬林固定，脫水、石蠟包埋、切片，經蘇木精-伊紅(HE)染色后，觀察腎臟各部位的組織病理學改變。

1.3.3 逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測磷酯酰肌醇3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)和核轉錄因子-κB(NF-κB)基因表達水平: 總RNA抽提。勻漿器加入1 mL Trizol Reagent, 置冰上預冷。取約100 mg新鮮腎臟于勻漿器中充分研磨，離心取上清，加入200 μL三氯甲烷，劇烈振蕩45 s, 使其充分混勻呈乳狀，室溫靜置3 min。4 ℃下12 000轉/min, 離心10 min, 上清液轉移到新離心管中，加入等體積異丙醇，顛倒混勻,-20 ℃放置5 min, 4 ℃下12 000轉/min, 離心10 min, 管底白色沉淀即為RNA。吸除上清液，加入75%乙醇1 mL顛倒混勻，使沉淀懸浮。4 ℃下12 000轉/min, 離心5 min, 棄上清液，吸凈管底乙醇，離心管置于超凈臺上吹3 min, 晾干沉淀。加入50 μL無RNA酶的水溶解RNA, Nanodrop 2000檢測RNA濃度及純度，濃度過高的RNA進行適當比例的稀釋，終濃度為100 ng/μL。反轉錄: PCR管加入含100 ng RNA以上的溶液作為反轉錄的模板。加入1 μL 特異性miRNA反轉錄引物，無核糖核酸酶去離子水補足至12 μL, PCR儀上65 ℃保溫5 min, 迅速置冰上冷卻。依次加入4 μL 5×ES Reaction Mix, 2 μL 10 mmol/L dNTPs, 1 μL RNA inhibitor和1 μL反轉錄酶，移液槍抽吸混勻。PCR儀上42 ℃保溫60 min, 結束后80 ℃保溫5 min滅活反轉錄酶。定量PCR: 取0.2 mL PCR管，配制反應體系(2×qPCR Mix 12.5 μL, 7.5 μmol/L基因引物2.0 μL, 反轉錄產物2.5 μL, 雙蒸水8.0 μL), 每個反轉錄產物配制3管。PCR擴增: 預變性95 ℃ 5 min, 循環(44次)95 ℃, 15 s→56 ℃, 30 s→72 ℃ 20 s, 熔解曲線75 ℃→95 ℃, 每20 s升溫1 ℃。△△CT法進行結果處理。

1.3.4 蛋白免疫印跡(Western Blot)法檢測各組PI3K、AKT和NF-κB 蛋白表達水平: 組織總蛋白提取。新鮮腎臟約100 mg用預冷磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次，去除血污，剪成小塊置于勻漿器中，加入蛋白質裂解液(RIPA∶PMSF∶磷酸酶抑制劑按100∶1∶1的比例配置)，冰浴徹底勻漿，將勻漿液轉移至離心管中，振蕩。冰浴30 min, 期間用移液器反復吹打，確保勻漿液完全裂解。4 ℃下13 000 g離心5 min, 收集上清液(總蛋白溶液)。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE): 根據樣品濃度確定上樣量，在蛋白樣品中加入蛋白上樣緩沖液, 100 ℃沸水浴5 min。配制分離膠加入四甲基乙二胺(TEMED)后立即搖勻灌膠。配制濃縮膠加入TEMED后立即搖勻灌膠，剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。拔出梳子，將電泳架放入電泳槽中，加入電泳緩沖液，將樣品加入點樣孔中。按濃縮膠50 V、分離膠120 V進行恒壓電泳。轉膜: 甲醇活化聚偏氟乙烯膜(PVDF)膜，按照正負極的方向擺放轉膜“三明治”結構, 100 V恒壓轉膜。抗體孵育: 轉好的膜加入封閉液，室溫封閉1 h, 除去封閉液，加入已稀釋的一抗4 ℃過夜。回收一抗，用洗膜緩沖液(TBST)洗3次，每次5 min, 加入稀釋好的二抗，室溫孵育30 min, TBST在室溫下搖床洗4次，每次5 min。化學發光檢測: 滴加新鮮配制的ECL混合溶液于膜的蛋白面側，暗室中曝光、顯影和定影。Image J軟件處理系統分析目標帶的光密度值。

1.3.5 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法檢測白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、白細胞介素-1β前體(Pro-IL-1β)、白細胞介素-1β(IL-1β)和轉化生長因子-β1(TGF-β1)表達水平: 取約100 mg新鮮腎臟樣本置于勻漿器內充分研磨, 5 000轉/min, 4 ℃離心5 min, 取上清液，按ELISA試劑盒檢測法檢測IL-6、TNF-α、MCP-1、Pro-IL-1β、IL-1β和TGF-β1 水平。

1.4 統計學分析

2 結 果

2.1 血漿中BUN、Cr、UA和XO水平測定

給藥前, 2組BUN、Cr、UA和XO水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。給藥后，實驗組BUN、Cr、UA和XO水平高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。見表1。

表1 2組大鼠給藥前后BUN、Cr、UA、XO水平

2.2 PI3K/AKT/NF-κB信號通路mRNA表達水平測定

實驗組PI3K、AKT和NF-κBmRNA 表達水平高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。見表2。

表2 2組大鼠PI3K、AKT、NF-κB mRNA表達水平

2.3 PI3K/AKT/NF-κB信號通路蛋白表達水平測定

實驗組PI3K、AKT和NF-κB 蛋白表達水平高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。見表3。

表3 2組大鼠PI3K、AKT、NF-κB蛋白表達水平

2.4 PI3K/AKT/NF-κB信號通路下游炎性細胞因子表達水平測定

實驗組TNF-α、MCP-1、IL-6、Pro-IL-1β和IL-1β水平高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。見表4。

表4 2組大鼠PI3K/AKT/NF-κB信號通路下游炎性細胞因子表達水平 pg/mL

2.5 2組大鼠腎臟組織病理學變化

對照組大鼠腎小管上皮結構正常，未見萎縮，未見明顯空泡變，管內無尿酸鹽結晶，間質無炎癥細胞浸潤。

實驗組大鼠腎小管上皮細胞可見不同程度變性壞死及囊性擴張，擴張小管內大量管型; 腎間質可見以中性粒細胞為主的大面積炎癥細胞浸潤，淋巴細胞、單核細胞等亦可見; 間質纖維增生，腎皮髓質、間質及小管內可見大小不等棕色結晶沉積，部分腎集合管內可見蛋白管型及紅細胞管型; 腎小球不同程度增大，腎小球囊壁層細胞肥大，內膜增厚，伴少量血漿滲出。見圖1。

A、B: 對照組大鼠腎臟組織HE染色; C、D: 實驗組大鼠腎臟組織HE染色。

3 討 論

高尿酸水平可導致多種靶器官功能損害，其主要發病機制有尿酸鹽沉積、免疫紊亂、炎癥損傷、腎素血管緊張素系統(RAS)激活、氧化應激和內質網應激等。細胞吞噬尿酸鹽晶體可通過激活補體系統及巨噬細胞，導致炎癥細胞因子表達增高，激發炎癥反應，導致臟器損傷[2]。腎小管細胞通過內吞尿酸晶體并釋放細胞因子，誘導局部炎癥反應，腎間質成纖維細胞分泌紊亂又可造成細胞外基質合成降解失衡，最終導致腎間質炎癥和腎間質纖維化[3-4]。

轉移生長因子(TGF)/smad、酪氨酸激酶(Syk)和寡聚化結構域樣受體蛋白3(NLRP3)/Toll樣受體(TLRs)等多種信號通路參與尿酸性腎病的發生發展過程[5]。PI3K/AKT/NF-κB信號通路已證實參與尿酸性腎病的發病過程。PI3K是由調節亞基p85和催化亞基p110組成的異二聚體，可接受來自G蛋白連接受體、酪氨酸激酶連接受體傳遞的信號，通過與連接蛋白相互作用，使二聚體構象改變而激活。AKT是PI3K的靶蛋白，可接收PI3K傳遞的生物信息，通過磷酸化途徑被激活。NF-κB可與基因啟動子固定核苷酸序列結合，調節編碼細胞因子，激活相關炎性細胞分化，引發炎癥反應[6-8]。

本研究通過建立尿酸性腎病大鼠動物模型，觀察尿酸性腎病大鼠PI3K/AKT/NF-κB信號通路目標基因mRNA、蛋白表達、炎性細胞因子水平變化和大鼠腎臟病理變化情況。本研究結果表明，與對照組相比，實驗組目標基因PI3K、AKT和NF-κBmRNA表達水平增高及其蛋白表達增加，炎性細胞因子NF-α、MCP-1、TGF-β1、IL-6、Pro-IL-1β和IL-1β表達水平增高。HE染色病理結果提示，實驗組大鼠腎小管上皮細胞不同程度變性壞死及囊性擴張，腎間質可見以中性粒細胞為主的大面積炎癥細胞浸潤，間質纖維增生，腎皮髓質、間質及小管內可見大小不等棕色結晶沉積，腎小球不同程度增大，腎小球囊壁層細胞肥大，內膜增厚，伴少量血漿滲出。

本研究發現，腎小管細胞可內吞尿酸結晶，可能通過激活PI3K/AKT/NF-κB信號通路并釋放炎癥因子，誘導炎癥反應，導致腎間質炎癥和腎間質纖維化。其可能的機制如下: ① PI3K與酪氨酸殘基受體結合后，生成磷酸化的磷脂產物，磷脂產物可將AKT轉位到細胞膜上[9]，在磷酸肌醇依賴性酶的作用下，參與細胞周期的調控，血管平滑肌細胞增生、遷移并發生血管重構。在腎間質和腎小管內，入球小動脈管壁增厚，引起管腔狹窄甚至管腔閉塞，導致腎灌注嚴重不足，促使腎纖維化，進而加重腎損害[10-12]。② 在高尿酸誘導的腎組織炎性損害中, NF-κB激活可引起一系列的酶促反應。胞內NF-κB誘導性激酶激活IκB激酶復合物，經過磷酸化、泛素化后轉移到細胞核，與基因上的κB位點發生特異性結合，促使腎小管上皮細胞賴氨酰氧化酶和MCP-1蛋白表達上調，細胞外基質纖連蛋白合成增加，基質蛋白沉積加速腎間質纖維化[12-14]; ③ 在PI3K/AKT/NF-κB信號通路激活狀態下，單核-巨噬細胞分泌TNF-α和IL-1β明顯增加，可反過來進一步活化NF-κB, 形成炎癥信號的正反饋，腎間質單核胞浸潤導致炎癥損傷，加劇腎間質炎性損傷和腎組織纖維化[13-14]。TNF-α還可使血管內皮舒張功能減退，從而影響腎臟血流動力學，使腎小球濾過率下降，加劇腎間質炎性損傷和腎組織纖維化[15]。④ IL-6、TGF-β1是導致腎小球硬化和腎臟疾病惡化的重要因素[16]。IL-6可通過自分泌與旁分泌的方式與TGF-β1相互作用，兩者相互促進引發炎癥級聯反應，加劇腎臟纖維化進程，同時還可以促進內皮細胞的促凝血活性，并增加系膜細胞蛋白激酶活性，加重腎損害[16-17]。

高尿酸激活PI3K/AKT/NF-κB信號通路，通過誘導血管重構、激活酶促反應、改變血流動力學和引發炎癥級聯反應等途徑，引起腎灌注不足、細胞外基質沉積加速和腎間質單核細胞浸潤等后果，導致腎間質炎性損傷和腎間質纖維化，這可能為尿酸性腎病發生發展的重要機制，未來或將成為尿酸性腎病干預及治療靶點。