祛痰化瘀中藥復(fù)方對(duì)心房顫動(dòng)模型大鼠心電圖及黏附分子P-Selectin、E-Selectin的影響

吳啟華，宮麗鴻，肖福龍

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110033；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110032)

心房顫動(dòng)(Atrial Fibrillation，AF)是最常見的慢性持續(xù)性心律失常，由于心房不協(xié)調(diào)的電活動(dòng)而引起。我國(guó)流行病學(xué)調(diào)查顯示，心房顫動(dòng)的發(fā)病率約為0.77%，隨著年齡增大而逐步增加[1]。AF可誘發(fā)心功能不全、腦栓塞及周圍血管栓塞，具有較高的致殘率和致死率，是當(dāng)前臨床較為棘手的心血管疾病。

近年來，大量研究證明炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激以及血栓的形成在房顫纖維化、電重構(gòu)以及不良預(yù)后中起到重要驅(qū)動(dòng)作用，黏附分子的作用與上述發(fā)病機(jī)制形成息息相關(guān)[2]。黏附分子在參與細(xì)胞間的識(shí)別、活化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及細(xì)胞的伸展與運(yùn)動(dòng)中起著重要作用，是一系列人體生理和病理過程如炎性反應(yīng)、免疫應(yīng)答、凝血、腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、愈合創(chuàng)傷等的分子基礎(chǔ)[3]。趙爽等[4]研究表明，氧化應(yīng)激時(shí)血管細(xì)胞黏附分子、P-選擇素及E-選擇素的表達(dá)水平明顯增加，即氧化應(yīng)激介導(dǎo)黏附分子的活化與升高。而選擇素為黏附分子的一種，是一類異親型結(jié)合、Ca2+依賴的細(xì)胞間黏著分子，可與特異糖基識(shí)別并結(jié)合，主要參與白細(xì)胞、血小板與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的識(shí)別與黏著，包括L-選擇素、P-選擇素(P-Selectin)和E-選擇素(E-Selectin)。

本實(shí)驗(yàn)采用Ach-CaCl2混合液尾靜脈注射的方式進(jìn)行大鼠AF造模，通過記錄大鼠心電圖AF的持續(xù)時(shí)間、心房肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化觀察祛痰化瘀中藥復(fù)方的療效，并進(jìn)一步檢測(cè)AF大鼠血清黏附分子P-Selectin、E-Selectin含量以探討祛痰化瘀中藥復(fù)方的作用機(jī)制，為AF的中醫(yī)治療提供了有效的思路和方法。

1 材料

1.1 動(dòng)物

雄性SPF級(jí)SD大鼠60只，體質(zhì)量(350±50)g，購買于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK(遼)2013-0009。飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，高脂飼料喂養(yǎng)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查編號(hào)：21000042021021。

1.2 藥物

祛痰化瘀中藥復(fù)方組成為桂枝6 g，炙甘草10 g，甘松10 g，龍骨25 g，牡蠣25 g，熟三七2 g，柴胡10 g，枳殼10 g，白芍10 g，僵蠶5 g，丹參15 g，竹茹10 g，陳皮15 g，半夏10 g，桑寄生10 g，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院熬制成100 mL/袋；鹽酸維拉帕米片(天津市中央藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H12020051)，規(guī)格 40 mg/片。

1.3 試劑

氯化乙酰膽堿(Ach)(源葉生物科技有限公司,S30170-5g，CAS#60-31-1，分子式C7H16CINO2)；無水氯化鈣(CaCl2)(源葉生物科技有限公司,S24110-500 g，CAS#10043-52-4)；10%水合氯醛溶液(飛凈生物科技有限公司，規(guī)格：100 mL)；大鼠P選擇素試劑盒、大鼠E選擇素試劑盒(江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司)。

1.4 儀器

PowerLab 15T多導(dǎo)電生理記錄儀(上海埃德儀器國(guó)際貿(mào)易有限公司，型號(hào)：mL4818)；哺乳動(dòng)物類手術(shù)器械一套；精密電子天平(丹佛儀器北京有限公司，京制00000249號(hào))；SIS透射電鏡數(shù)字?jǐn)z像頭(TEM CCD Camera)(德國(guó)EMSIS，型號(hào)：MORADA)；酶標(biāo)儀(Model680，Bio-Rad，美國(guó))。

2 方法

2.1 造模方法與分組

60只雄性SD大鼠隨機(jī)分為空白組(Control組)10只和造模組(Model組)50只，本實(shí)驗(yàn)參照陳春林《大鼠心房顫動(dòng)模型的建立》[5]中造模方法，連續(xù)7 d經(jīng)大鼠尾靜脈注射Ach(66 μg/mL)-CaCl2(10 mg/mL)混合液制備AF大鼠模型，按0.1 mL/100 g計(jì)算給藥體積。

造模第7天，所有大鼠稱體質(zhì)量，10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)進(jìn)行麻醉。連接PowerLab 15T多導(dǎo)電生理記錄儀，測(cè)量Ⅱ?qū)?lián)心電圖，以心電圖中出現(xiàn)f波、P波消失，P-R間期絕對(duì)不等為AF發(fā)生的標(biāo)志，以P波出現(xiàn)、f波消失為AF終止標(biāo)志，計(jì)算出AF持續(xù)時(shí)間。將造模成功的50只大鼠隨機(jī)分成模型組(Model組)、中藥高劑量組(High dose組)、中藥中劑量組(Middle dose組)、中藥低劑量組(Low dose組)、維拉帕米組(Verapamil組)，每組10只。

2.2 藥物干預(yù)

造模成功后第2天灌胃，給藥劑量參考徐叔云主編的《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[6]中關(guān)于人與動(dòng)物按體表面積的等效劑量比值(1∶6.25)系數(shù)折算，中藥復(fù)方高、中、低劑量組分別給予41.25、20.63、10.31 g·kg-1·d-1灌胃，Verapamil組給予維拉帕米片25 mg·kg-1·d-1灌胃，正常組與模型組給予生理鹽水灌胃，連續(xù)給藥2周。期間仍持續(xù)尾靜脈注射Ach-CaCl2，于灌胃1 h后進(jìn)行。

2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

2.3.1 心電圖測(cè)量大鼠AF的持續(xù)時(shí)間

大鼠禁食不禁水12 h，稱體質(zhì)量，采用水合氯醛麻醉。連接并測(cè)量Ⅱ?qū)?lián)心電圖，動(dòng)態(tài)觀察5 min。

2.3.2 透射電鏡觀察大鼠心房肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

開胸暴露心臟后，用移液槍抽取戊二醛固定液，滴入活體組織上，剪取心臟，將心房肌修剪成1 mm3左右的小塊，放入盛有1 mL 4%戊二醛固定液的EP管中待用。

2.3.3 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血清P-Selectin、E-Selectin的含量

記錄心電圖后，沿腹正中線向兩側(cè)剪開皮膚，暴露腹腔，進(jìn)行腹主動(dòng)脈采血,2 000 r/min離心10 min，ELISA法檢測(cè)各組大鼠血清P-Selectin、E-Selectin的含量，按試劑盒說明書操作，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值并計(jì)算濃度。

2.4 統(tǒng)計(jì)方法

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠心電圖AF持續(xù)時(shí)間比較

造模后，所有大鼠均出現(xiàn)明顯房顫心電圖，造模成功率100%。與Control組比較，造模組均出現(xiàn)典型的AF(P<0.01)；與Model 組比較，用藥后大鼠AF的持續(xù)時(shí)間均明顯縮短，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1、圖1～2。

圖1 正常大鼠心電圖

表1 各組大鼠AF持續(xù)時(shí)間比較

3.2 各組大鼠心房肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化

透射電鏡結(jié)果顯示，Control組大鼠心房肌細(xì)胞的肌小節(jié)完整清晰，“Z”帶排列整齊連貫，I帶清晰可見，肌絲排列整齊緊密，線粒體結(jié)構(gòu)正常，線粒體嵴結(jié)構(gòu)完整。Model 組大鼠心房肌細(xì)胞的肌小節(jié)斷裂，“Z”帶不連續(xù)，排列混亂，“I”帶模糊不清，心肌細(xì)胞肌絲溶解斷裂，出現(xiàn)空隙，線粒體腫脹、增多，甚至破裂，嵴斷裂溶解，聚集在一起，呈空泡樣改變。High dose組、Middle dose組、Verapamil組大鼠心房肌細(xì)胞的肌小節(jié)輕微斷裂，排列相對(duì)整齊，肌絲稍有溶解，線粒體稍有腫脹、增多，但嵴溶解明顯減少，結(jié)構(gòu)相對(duì)完整。Low dose組大鼠心房肌細(xì)胞的肌小節(jié)斷裂，“Z”帶不連續(xù)，排列不整齊，“I”帶模糊不清，仍有線粒體腫脹、增多，嵴斷裂溶解，個(gè)別線粒體結(jié)構(gòu)不完整。見圖3。

圖2 房顫發(fā)生時(shí)心電圖

圖3 各組大鼠心房肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化(透射電鏡，×10 000)

3.3 各組大鼠血清P-Selctin、E-Selectin含量比較

與Control組比較，Model組大鼠血清P-Selectin、E-Selectin含量顯著升高(P<0.01)；與Model組比較，中藥復(fù)方組大鼠血清P-Selectin、E-Selectin含量均明顯降低(P<0.01)；High dose組、Middle dose組較Low dose組降低更為顯著(P<0.05)，Verapamil組大鼠血清P-Selectin含量未見明顯改善(P>0.05)；High dose組、Middle dose組、Verapamil組大鼠血清E-Selectin含量均明顯降低(P<0.01)，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而Low dose組大鼠血清E-Selectin含量未見明顯改善(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清P-Selectin、E-Selectin含量比較

4 討論

在中醫(yī)學(xué)中，房顫屬于“心悸”“怔忡”等范疇。成無己《傷寒明理論·悸》曰：“其停飲者，由水停心下……水既內(nèi)停，心不自安，則為悸也”[7]。《諸病源候論》所言：“風(fēng)驚悸者，由體虛，心氣不足，心之府為風(fēng)邪所乘，或恐懼憂迫，令心氣虛”。故此中藥復(fù)方針對(duì)的心房顫動(dòng)的發(fā)病機(jī)理為內(nèi)有痰瘀之實(shí)，久則化火生風(fēng)，風(fēng)邪挾痰瘀擾動(dòng)心之脈絡(luò)。本方在溫膽湯基礎(chǔ)上進(jìn)一步創(chuàng)新化裁而來，《醫(yī)學(xué)入門》曰：“心與膽相通，心病怔忡，宜溫膽湯”。方中竹茹、陳皮、半夏、苦參、丹參、僵蠶為君藥，半夏、陳皮有“二陳”之意，燥濕化痰不言自明，竹茹清熱燥濕、化痰降氣共同調(diào)暢脾胃，使痰濕自化，丹參養(yǎng)血活血、祛瘀通絡(luò)，配伍僵蠶取其息風(fēng)通絡(luò)之功效，以抑制“風(fēng)動(dòng)”之象；柴胡、枳殼、白芍、桑寄生為臣，共奏調(diào)暢氣機(jī)，交通心腎之效；白芍養(yǎng)陰柔肝、養(yǎng)血，抑制肝風(fēng)，桑寄生入肝腎經(jīng)，具有祛風(fēng)、補(bǔ)肝腎的功用，二藥使氣機(jī)升降得暢，心腎水火既濟(jì)。心臟的正常搏動(dòng)有賴于心之陽氣的推動(dòng)和溫煦，是心搏跳動(dòng)之源頭動(dòng)力，論遂佐以桂枝甘草龍骨牡蠣湯意在振奮心陽，溫養(yǎng)心神，恢復(fù)正常竇房結(jié)功能[8]。甘松為使，行氣開郁，醒脾健胃，以化痰飲。全方共奏清熱祛痰化瘀、熄風(fēng)定悸安神功效。

選擇素-P又稱CD62P，是分子量為140 kDa的跨膜糖蛋白。馬曉蕓等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在基因水平上，P-Selectin的2123C>G、-1817T>C與房顫合并血栓具有明顯相關(guān)性。MIANMINO等[10]認(rèn)為P-選擇素介導(dǎo)血小板黏附于內(nèi)皮細(xì)胞, 激活中性粒細(xì)胞以及二者的黏附、聚集，釋放血管活性物質(zhì)和氧代謝產(chǎn)物, 導(dǎo)致血管收縮, 啟動(dòng)血栓形成，是血小板活化的標(biāo)志。同時(shí)，因?yàn)镻-選擇素對(duì)中性粒細(xì)胞具有趨化作用，還能上調(diào)單核細(xì)胞表達(dá)，并可導(dǎo)致單核細(xì)胞在損傷血管內(nèi)皮的聚集，激活炎癥細(xì)胞，擴(kuò)大局部炎癥反應(yīng)[11]。選擇素-E，又稱CD62E，是分子量約為115 kDa的糖基化單鏈跨膜蛋白。有研究顯示，當(dāng)人體內(nèi)有嚴(yán)重的炎性反應(yīng)出現(xiàn)時(shí)，血清中E-Selectin會(huì)出現(xiàn)高水平表達(dá)，特別在心血管疾病中[12]。E-Selectin只在內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)，可使激活的內(nèi)皮細(xì)胞與中性多形核細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞黏附，反應(yīng)機(jī)體炎癥反應(yīng)和內(nèi)皮功能，與房顫的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)研究中，所有用藥組大鼠AF的持續(xù)時(shí)間均有不同程度降低(P<0.05)，用藥干預(yù)后肌絲排列相對(duì)整齊，線粒體結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，Model組大鼠血清P-Selectin、E-Selectin含量均升高(P<0.01)，用藥后二者含量出現(xiàn)不同程度的降低(P<0.01)，說明本中藥復(fù)方抑制了房顫過程中炎癥細(xì)胞和血小板的聚集，從而抑制了炎癥反應(yīng)和血栓前狀態(tài)。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，溫膽湯可能通過降低血脂、改善血中化學(xué)成分、增加紅細(xì)胞和血小板表面電荷，從而降低兩者之間的聚集，改善血液高凝狀態(tài)[13]。楊溶海等[14]研究表明丹參多酚酸鹽具有降低臨床急性心肌梗死患者血清中P-Selectin、E-Selectin的水平，可能機(jī)制為通過抑制血小板聚集、抗血栓形成、清除自由基、抗氧化、調(diào)節(jié)血脂代謝與內(nèi)皮細(xì)胞功能[15]，進(jìn)而達(dá)到穩(wěn)定斑塊的作用。半夏可降低血液黏稠度、抑制紅細(xì)胞聚集和抗心律失常[16]；黃芩可改善血管,預(yù)防血栓的形成;三七主要活性成分三七總皂苷可調(diào)節(jié)COX2表達(dá)、抑制 COX1 表達(dá)、降低血小板上清液 TXB2 濃度，抑制 TXA2 途徑來抗血小板；保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞抑制血小板黏附[17]。

綜上所述，祛痰化瘀中藥復(fù)方可降低大鼠AF的持續(xù)時(shí)間，改善心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的損傷，降低AF大鼠血清中P-Selectin、E-Selectin的含量，抑制血小板和炎癥細(xì)胞等活化和聚集，為AF的中醫(yī)治療提供新的治療思路和方法。