胃癌患者血清Linc00659水平變化及其臨床意義

單萬碩，楊晶，張亞和

(萬寧市人民醫院 1.消化內科，2.腫瘤內科，海南 萬寧 571500)

胃癌是發展中國家最常見的惡性腫瘤之一，其5年生存率低于20%，部分原因是由于缺乏有效的早期診斷方法和預后指標[1]。在不同類型的癌癥中，基因組不穩定性與染色體畸變有關[2]。比較基因組雜交(CGH)數據表明，胃癌細胞中DNA拷貝數的增加經常出現在染色體20q長臂(20q13.33)上，其擴增解除了多種特定的癌癥相關信號通路的調控[3- 4]。因此研究20q13.33擴增的lncRNAs有可能為胃癌診斷和靶向治療提供新的見解。為了探索位于擴增的20q13.33上的lncRNAs的貢獻，我們分析了癌癥基因組圖譜(TCGA)數據，鑒定了4種lncRNAs，即RTEL1- TNFRSF6B[5]、SLCO4A1- AS1[6]、ZBTB46- AS1[7]和Linc00659，它們在胃癌組織和癌旁組織中存在差異表達，然而只有Linc00659與胃癌患者的預后相關。而且目前對于Linc00659在胃癌發生中作用的關注度較低，因此本研究旨在通過生物信息學和臨床研究進一步評估Linc00659在胃癌中的表達水平和生物學作用，進而為證實Linc00659是一種新的胃癌候選lncRNA提供可靠證據。

1 資料和方法

1.1 臨床樣本來源

從2017年12月至2020年9月，我們連續招募了226例胃癌患者(胃癌組)、67例癌前病變患者(癌前病變組)、70例胃良性病變患者(胃良性病變組)和45例健康對照者(健康對照組)。胃癌經胃鏡檢查結合活檢確診，之前接受過放化療、細胞毒性治療或靶向治療的患者被排除在外。臨床分期根據第八屆美國癌癥聯合委員會(AJCC)腫瘤淋巴結轉移(TNM)分期系統[8]確定。病理分級根據世界衛生組織的標準[9]確定。胃良性病變(包括慢性萎縮性胃炎、胃潰瘍和胃息肉)和癌前病變(上皮內瘤變)通過內窺鏡檢查進行診斷，并通過活檢進行確認。通過C13或C14呼吸試驗確認幽門螺桿菌(Hp)感染。健康對照者是從在我院接受常規健康檢查的人群中招募的，無可檢測到的癌癥或其他胃病，且腫瘤標志物水平正常。所有參與研究的受試者或其親屬均簽署書面知情同意書。本研究得到了我院醫學倫理委員會的批準，根據規定使用血清樣本。

1.2 樣本的獲取及檢測

根據標準方案采集血樣。將20 ml靜脈血吸入涂有EDTA的真空管中靜置30 min，并在室溫下以3 000 r·min-1的轉速離心15 min。隨后，用唯一標識符標記血清樣本，并將其儲存在-80 ℃下。此外，收集患者活檢組織樣本。應用TRIzol試劑(美國Invitrogen)提取血清或組織總RNA，使用HiFiScript cDNA合成試劑盒(中國北京康為世紀生物科技有限公司)將RNA反向轉錄成cDNA，使用PCR檢測系統(LightCyler?480，中國上海羅氏診斷產品有限公司)和RealSYBR混合物(中國北京康為世紀生物科技有限公司)進行實時熒光定量PCR反應。擴增的熱循環條件為：95 ℃ 5 min； 95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共40個循環；72 ℃ 10 min。將U6用作內部參考，以獲得相對閾值周期(Ct)值。Linc00659的表達使用2-ΔΔCt方法計算，結果描述為平均值±標準差。Linc00659引物：正向5′- UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3′，反向5′- ACGUGACACGUUCGGAGAATT- 3′；U6引物：正向5′- CTCGCTTCGGCAGCACA- 3′，反向5′- AACGCTTCACGAATTTGCGT- 3′。

1.3 TCGA數據分析

為了探索位于擴增的20q13.33上的lncRNAs的貢獻，從TCGA數據庫(http:∥cancergenome.nih.gov/)下載處理過的基因表達數據，包括胃癌患者的腫瘤樣本(n=408)和正常樣本(n=36)，收集每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取的標準化片段數值(FPKM)，并將其轉換為log2數據形式。根據Linc00659的中位表達水平(FPKM值=37)，將腫瘤樣本分為高表達組和低表達組，5年總生存(OS)和無病生存(DFS)分析采用生存數據包(https:∥cran.r- project.org/web/packages/survival)在R軟件中進行Kaplan- Meier生存曲線分析。

1.4 基因集富集(GSEA)分析

從GSEA網站(http:∥www.gsea- msigdb.org/gsea/downloads.jsp)下載GSEA 2- 2.2.3(JAVA版本)，然后導入下載的數據集。在MSigDB分子特征數據庫(http:∥software.broadinstitute.org/gsea/msigdb)根據默認的加權富集統計方法，每次分析重復模擬1 000次。選擇錯誤發現率<0.25和P<0.05的基因集。

1.5 目的基因預測

使用DESeq2包從Linc00659高表達和低表達組的腫瘤樣本中獲得差異表達基因(DEG)，|Log2倍變化(FC)|>1.5和調整后的P<0.01被用作DEGs分析的篩選閾值。使用clusterProfiler軟件包對這些基因進行基因本體(GO)富集分析，以闡明其涉及的生物學過程、分子功能和細胞成分。同時，進行京都基因與基因組百科全書(KEGG)信號通路分析，以闡明哪些信號通路參與調控。通過計算Pearson相關系數和Z檢驗確定Linc00659共表達與所有蛋白編碼基因(PCG)之間的相關性。與Linc00659正相關或負相關的PCG被認為是Linc00659相關PCG(| Pearson相關系數|>0.4，P<0.01)。

1.6 統計學處理

使用SPSS 22.0軟件進行統計分析。所有實驗至少獨立進行3次，數據描述為中位值(四分位距)，進行K-S檢驗和Post- hoc檢驗，用Bonferroni法調整α值。Fisher精確檢驗或χ2檢驗用于分析Linc00659表達與臨床病理參數之間的關系。繪制受試者工作特征(ROC)曲線，計算血清Linc00659水平診斷胃癌的曲線下面積(AUC)。采用Pearson或Spearman相關系數進行相關性分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 TCGA數據分析

通過TCGA數據庫篩選，鑒定出4種位于20q13.33區域的lncRNAs，包括RTEL1- TNFRSF6B、SLCO4A1- AS1、ZBTB46- AS1和Linc00659，他們在胃癌組織中的表達水平顯著上調(圖1A、B)。Linc00659表達上調與不良預后相關(P=0.040，圖1C)，與Ⅰ- Ⅲ期患者相比，Ⅳ期胃癌患者胃癌組織Linc00659表達水平顯著升高(P=0.022，圖1D)。RTEL1- TNFRSF6B、SLCO4A1- AS1、ZBTB46- AS1與OS或腫瘤分期無關(P>0.05)。

A. Linc00659位于Chr20q13.33上；B.位于Chr20q13.33上的4個lncRNAs的表達水平；C.使用對數秩檢驗分析胃癌患者(分為高和低Linc00659表達組)的總生存率和無病生存率；D.不同臨床分期胃癌組織中Linc00659的表達差異圖1 TCGA數據庫分析

2.2 GSEA分析

使用TCGA數據對胃癌中Linc00659表達水平進行GSEA分析，結果表明Linc00659表達水平與上皮細胞遷移和上皮間充質轉化途徑相關(圖2)。 GO和KEGG分析顯示，Linc00659潛在的DEGs主要聚集在鈣信號通路、磷酸化通路和黏附相關通路。

圖2 胃癌中Linc00659表達水平的GSEA分析

2.3 TCGA數據庫中與Linc00659共表達相關的蛋白編碼基因

Pearson相關分析顯示，含有GTPase激活蛋白3(IQGAP3)、基質金屬蛋白酶15(MMP15)、整合素亞單位α6(ITGA6)、G蛋白偶聯受體C組5成員A(GPRC5A)、TNF受體相關因子4(TRAF4)、角蛋白8(KRT8)、吞噬和細胞運動3(ELMO3)7種基因的表達水平與Linc00659的表達呈正相關(圖3)。

圖3 TCGA數據庫中與Linc00659共表達的7種蛋白編碼基因的相關性分析

2.4 臨床樣本中Linc00659表達水平的差異

胃癌組、癌前病變組、胃良性病變組、健康對照組血清Linc00659表達水平分別為2.09(1.53，3.13)、1.37(1.01，2.36)、1.17(0.85，1.65)、0.94(0.72，3.13)，胃良性病變組、健康對照組相比差異無統計學意義(P>0.05)，但是胃癌組、癌前病變組血清Linc00659水平均高于胃良性病變組、健康對照組(P<0.05)，而且胃癌組較癌前病變組升高更顯著(P<0.05)。此外，胃癌患者活檢組織Linc00659表達水平[3.15(2.12，3.99)]高于胃良性病變組[1.80(1.23，2.50)，P<0.05]和癌前病變組[2.12(1.56，3.01)，P<0.05]，而且癌前病變組活檢組織Linc00659表達水平高于胃良性病變組(P<0.05)。Spearman相關分析顯示，胃癌患者血清Linc00659水平與活檢組織Linc00659表達水平呈正相關(r=0.715，P<0.001)。ROC曲線分析顯示，血清Linc00659用于胃癌診斷以及區分胃癌和癌前病變患者的AUC為0.841(95%CI0.800～0.882)、0.797(95%CI0.739～0.855)，見圖4。

圖4 血清Linc00659用于胃癌診斷以及區分胃癌和癌前病變患者的ROC曲線分析

2.5 胃癌患者術前血清ITGβ6水平與臨床特征的關系

根據血清Linc00659基線水平中位值，將患者分為高水平亞組(>2.09)和低水平亞組(≤2.09)。在臨床病理特征中，pT分期(P=0.033)、pTNM分期(P=0.036)、血管侵犯(P=0.001)、微衛星不穩定性(MSI)(P=0.004)與血清Linc00659基線水平相關(表1)。

表1 胃癌患者術前血清Linc00659水平與臨床特征的關系 例

(續表)

3 討 論

越來越多的研究表明，lncRNAs在癌癥中起著關鍵作用，盡管在人類基因組中發現了大量lncRNAs，但只有少數lncRNAs經過實驗驗證，并在胃癌中進行了功能注釋[10- 12]。胃癌的起始和進展涉及多種lncRNAs的調控或去調控。一些lncRNA功能已被發現，并有望成為胃癌預后和治療的潛在生物標志物和治療靶點[12- 13]。基因組擴增是癌癥的標志，通常使用定位于擴增子上的非編碼元件(如lncRNAs)來描述它們在惡性轉化中的作用[14]。在本研究中，我們證實Linc00659在胃癌血清樣本和活檢組織樣本中的表達量增加，初步臨床數據顯示Linc00659與胃癌惡性化進展相關，且血清Linc00659有望成為胃癌診斷生物標志物。

在不同類型的癌癥中，基因組不穩定性與染色體畸變有關，這可能涉及多種抑癌基因突變，并進一步促進腫瘤進展[2,15]。比較基因組雜交(CGH)數據表明，DNA拷貝數的增加經常出現在染色體1q、3q、5p、7p、7q、8q、11q、17q、20p和20q上，而在胃癌細胞中的染色體3p、4p、4q、8p、9p、18p、18q、20q上經常檢測到一個拷貝的丟失[2- 4,15,16- 18]。在胰腺癌、乳腺癌、結腸癌和胃癌等多種類型的癌癥中已經觀察到幾種染色體畸變，尤其是20q的擴增，這意味著20q的增加可能在腫瘤發生中起著至關重要的作用。染色體20q上的擴增基因包含各種功能上重要的基因，這些基因涉及細胞周期調節(E2F1、TPX2、KIF3B、PIGT和B4GALT5)、核功能(CSEL1)、病毒復制(PSMA7和LAM5)、甲基化和染色質重塑(ASXL1、AHCY和C20orf20)以及轉錄調節(TCEA2)[15- 19]。染色體20q的擴增解除了幾種特定的癌癥相關信號通路的調控，包括MAPK和p53信號通路[4,15]。在TCGA數據庫中，胃癌患者組織Linc00659表達上調與不良預后相關。染色體重復和基因擴增的改變對癌基因的功能獲得和過度表達至關重要。根據CGH分析，在包括胃癌在內的多種類型的癌癥中觀察到了幾種染色體畸變，尤其是20號染色體長臂(20q13.33)的反復增益和擴增。CGH經常在20號染色體上擴增，該染色體在20q13.33中有許多胃癌易感性位點[2- 4,15]。為了探索位于擴增20q13.33上lncRNAs的貢獻，我們通過篩選TCGA數據庫分析胃癌中lncRNAs的表達水平。與非腫瘤組織相比，發現4種lncRNAs，即RTEL1- TNFRSF6B、SLCO4A1- AS1、ZBTB46- AS1和Linc00659在胃腫瘤組織中的表達水平顯著上調。隨后，使用對數秩檢驗進行Kaplan- Meier分析，證實與低水平Linc00659表達的患者相比，高水平Linc00659表達的患者OS時間顯著縮短。此外，與Ⅰ- Ⅲ期患者相比，晚期胃癌(Ⅳ期)患者組織Linc00659表達水平顯著升高，而其他3種lncRNAs與腫瘤分期或生存預后無關。這些數據表明，Linc00659表達水平升高的胃癌患者可能更容易進展到疾病晚期，這與本研究中收集的我院臨床樣本數據基本相符。

之前有研究表明，Linc00659是一種新的致癌lncRNA，敲除Linc00659表達可損害細胞周期進程，并抑制PI3K- AKT信號傳導，進而顯著抑制結腸癌細胞增殖[20]。隨后Sheng等[21- 22]研究也證實，Linc00659在胃癌細胞系SGC- 7901和BGC- 823中表達增加，共表達分析進一步揭示了轉錄因子SUZ12和Linc00659之間的相關性。在本研究中，血清Linc00659在胃癌患者中的表達被證明是上調的，且其高表達水平與臨床分期進展和血管侵犯相關。此外，ROC曲線分析證實，血清Linc00659對于胃癌診斷以及區分胃癌和癌前病變患者都具有良好的臨床效能，AUC值分別為0.841(95%CI0.800～0.882)和0.797(95%CI0.739～0.855)。利用GSEA分析證實，在高Linc00659表達表型中，上皮細胞遷移和上皮間充質轉化途徑的負調控顯著差異富集。通過GO和KEGG分析顯示，Linc00659潛在的DEGs主要聚集在鈣信號通路、磷酸化通路和黏附相關通路。這些數據表明，Linc00659的功能可能與參與胃癌轉移的細胞遷移和侵襲有關。這也為Linc00659用于胃癌候選診斷和治療靶點提供了證據支持。

盡管本研究提高了我們對Linc00659與胃癌之間關系的認識，但仍存在一些局限性。首先，為了充分闡明Linc00659在胃癌發展和進展中的特殊作用，應包括所有臨床因素，如患者治療細節及預后。然而，在本研究中，此類信息缺乏或處理不一致。其次，本研究只提供了臨床樣本數據和生物信息分析，沒有進行基礎實驗驗證。下一步的工作需要進行綜合的、完善的體外和動物體內基礎實驗分析。第三，單組學對基因功能的理解并不全面，因此應擴展到多組學研究，尤其是蛋白質水平及其功能機制的研究。第四，缺少外部數據集驗證可能會導致偏差。

總之，目前的臨床研究結果表明，Linc00659有望成為胃癌診斷和惡性進展的一個重要分子標志物，在將來也可能成為一個新的有前途的治療靶點。而且上皮細胞遷移和上皮間充質轉化途徑可能是Linc00659促進胃癌進展的假定分子機制，盡管其機制需要進一步研究。