SFRP1及Dickkopf相關蛋白1在慢性牙周炎患者牙齦組織中的表達及意義

陳欣，尼加提·吐爾遜，熱依拉·庫爾班

(新疆醫科大學第二附屬醫院口腔科，新疆 830001)

近年來，隨著人們生活品質的不斷提高，對口腔衛生問題重視程度逐漸加強，與之相關的慢性牙周炎(chronic periodontitis，CP)也逐漸成為了研究領域中的熱點話題。CP是由菌斑、細菌引起牙周組織的一種慢性炎癥性疾病[1]，常發生在牙周膜、牙齦、牙槽骨、牙骨質，其中牙槽骨的吸收是其較嚴重的病變，最終可導致牙齒的松動及脫落，對患者的生活質量造成嚴重影響[2]。有研究[3]表明，Wnt信號通路在成骨細胞的定向、分化、發育、增殖等生理過程中具有關鍵作用，是骨代謝調控的重要途徑，也是一種檢測骨喪失的生物標志物。Wnt信號因子在牙周組織中的表達異常與慢性牙周炎的進展程度相關[4]。分泌型卷曲相關蛋白(secreted frizzled-related protein 1，SFRP1)是Wnt信號通路的重要拮抗劑，可競爭結合Wnt蛋白從而抑制Wnt通路激活[5]，能夠減少炎癥細胞及破骨細胞數量，降低牙周支持骨組織的破壞。另一組分泌型糖蛋白(Dickkopf1，DKK1)作為Wnt信號通路有力的抑制劑，抑制了牙周膜成纖維細胞中由Wnt介導的成骨活動，對分化起到抑制作用，同時促進骨的破壞[6-7]。本研究通過檢測SFRP1和DKK1在CP患者和正常者牙齦組織中的表達水平情況，研究Wnt信號通路經典拮抗分子SFRP1和DKK1與CP的相關性，探討SFRP1和DKK1兩種蛋白在成人慢性牙周炎中發生及發展過程中的作用關系。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取2020年1月至2020年12月就診于新疆醫科大學第二附屬醫院口腔醫學中心的患者，其中被診斷為中、重度CP患者30例(男性18例、女性12例)為實驗組，年齡35～60歲，平均(46.37±5.31)歲；病程1～6年，平均(2.62±0.70)年。牙周健康者15名(男性8名，女性7名)為對照組，年齡33～61歲，平均(46.58±5.22)歲。兩組性別占比和年齡比較，差異無統計學意義(P>0.05)。納入標準：全身健康狀況良好，無系統性疾病；無吸煙史或長期酗酒史；近3個月未服用抗生素、非甾體類抗炎藥物及其他免疫抑制劑等藥物；無累及牙齦的黏膜疾病；診斷為慢性牙周炎患者，全口余留牙≥18顆，且近半年內未接受過牙周系統治療者；女性未處于妊娠或哺乳期；無正畸治療史。本研究經本院醫學倫理委員會研究批準(批準號：L2021013)，患者及家屬均簽署研究知情同意書。

1.2 主要試劑及儀器

重組Anti-SFRP1抗體、重組Anti-DKK1抗體(Abcam公司，美國)，免疫組織化學染色試劑盒、DAB顯色試劑盒(福州邁新生物技術開發有限公司)，山羊抗兔、鼠IgG H&L (HRP)(Abcam公司，美國)，顯微鏡(Nikon生物顯微鏡)，化學發光成像儀系統(上海勤翔科學儀器有限公司)等。

1.3 實驗標本采集

選取實驗組患者牙周手術中切取的口腔內牙周炎病灶部位的牙齦組織(排除根尖周組織疾病)；對照組取自拔除智齒或正畸牙過程中切取的健康牙齦組織。組織標本離體后沖洗干凈，濾紙吸干。

1.4 實驗方法

1.4.1 牙齦組織的蘇木精-伊紅染色(HE染色) 將標本用10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，將包埋好的組織蠟片切片，常規進行HE染色，用ChemiScope mini化學發光儀檢測、拍照，觀察CP組牙齦組織的病理學改變，以及正常組的牙齦形態和組織結構，明確慢性牙周炎診斷。

1.4.2 牙齦組織的免疫組化檢測(SP法) 將包埋好的牙齦組織蠟塊連續切片，切片厚度4 μm，脫蠟復水，浸入乙二胺四乙酸抗原修復，放入濕盒中滴加過氧化氫溶液封閉內源性過氧化物酶，分別加入SFEP1及DKK1工作液孵育。配置DAB顯影液避光反應，復染，脫水封片，通過顯微鏡觀察組織陽性染色程度。用蘇木素復染胞核，鏡下觀察。以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照，以明確表達SFRP1及DKK1的卵巢組織作為陽性對照。

1.4.3 免疫組化結果判定 SFRP1、DKK1在牙齦組織中的表達使用著色強度積分進行雙評分法判定[8]，在光鏡下每張切片隨機選擇5個視野(400×)，觀察陽性染色的細胞百分比及著色程度。以有棕黃色顆粒狀沉淀為陽性細胞，著色范圍以陽性染色百分比<1%為0分，2%～20%為1分，21%～50%為2分，≥50為3分；著色程度依據深淺記分，陰性著色為0分，淺黃色為1分，淺褐色為2分，深褐色為3分。上述兩者相加作為著色強度的積分值。

1.4.4 牙齦組織蛋白印跡法(WB)檢測 將收集到的實驗組和健康組的牙齦組織，置于EP管中，放入液氮內速凍，再轉移至-80 ℃冰箱中保存。樣本稱重研磨之后，加入10倍RIPA裂解液離心15 min，收集上清液檢測蛋白濃度，剩余加入5倍緩沖液加熱使蛋白變性，和配制的BCA工作液加入孔板中，酶標儀562 nm處檢測其吸光度，根據標準曲線計算出樣品中的蛋白濃度，將蛋白樣品濃度與標準蛋白曲線對應計算。蛋白分離置PVDF膜，將三種目的蛋白進行切割，分別孵育三種抗體，包括SFRP1、DKK1以及內參抗體β-actin。用TBST漂洗一抗孵育后的PVDF膜和HRP標記的山羊抗兔血清(二抗)，運用增強化學發光法顯影，用ChemiScope mini化學發光儀檢測、拍照。采用Image J軟件檢測目的條(SFRP1、DKK1)及內參條(actin)的灰度值，兩者比值即為蛋白表達的相對信號強度。比較各組間SFRP1及DKK1相對信號強度的差異。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 牙齦組織HE染色

鏡下觀察，健康組：鏡下見復層鱗狀上皮，皮下固有層纖維結締組織內少量慢性炎細胞浸潤，未見明顯異常；CP組：鏡下見復層鱗狀上皮，部分變薄，表面糜爛、潰瘍形成，部分棘層肥厚，釘突增生，部分網狀增生，皮下固有層纖維結締組織內大量慢性炎細胞(淋巴細胞、漿細胞)浸潤伴纖維肉芽組織增生，局灶可見較多中性粒細胞浸潤。見圖1。

2.2 免疫組織化學試驗測定各組SFRP1與DKK1的定位與陽性表達情況

鏡下觀察，健康組牙齦組織鱗狀上皮SFRP1和DKK1蛋白少見淺黃色顆粒狀，表達弱，陽性表達少；中度CP組和重度CP組牙齦組織均見淺黃色顆粒狀。分析發現，DKK1和SFRP1著色強度積分中度CP組中高于健康組，重度CP組高于輕度CP組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1、圖2、圖3。

表1 各組牙齦組織中SFRP1和DKK1著色強度積分比較M(P25，P75)

2.3 牙齦組織WB實驗

健康組中的SFRP1及DKK1在牙齦組織中的表達水平均比CP組降低，差異有統計學意義(P<0.05)。表2。

表2 SFRP1和DKK1在牙齦組織中的表達水平分析

3 討論

有研究[9]發現Wnt信號通路與骨的發育和代謝密切相關，誘導間質干細胞向成骨分化，促進或抑制成骨細胞和破骨細胞的增殖與分化。同時有研究[10]在不同的微環境下Wnt信號通路調控牙周膜干細胞上的成骨分化，炎癥因子的表達增高，加重牙周組織的破壞。

SFRP1、DKK1通過競爭結合抑制Wnt通路，成為Wnt經典信號通路重要的抑制劑，可以阻止 Wnt蛋白的下行轉導，阻礙成骨細胞的活動，抑制骨的形成[11]，廣泛應用于研究。有研究[12]指出牙周炎患者血清中SFRP1高表達狀態時與牙周破壞程度呈正相關，并隨著破壞程度的加重而逐漸升高。本研究結果顯示，輕度CP組的SFRP1陽性積分值、蛋白表達水平均高于正常組，重度CP組高于輕度CP組。證明此蛋白作為分泌型蛋白可能通過在血液中的擴散等途徑影響牙周炎的發展。在Li等[13]研究中，SFRP1蛋白在牙周中與成骨細胞和成纖維細胞凋謝有關，此蛋白的高表達可能促使與牙周成骨細胞表達相關基因沉默，從而引起成骨細胞的凋亡，造成牙周炎中牙槽骨的缺損流失。

研究[14]發現DKK1在牙周膜干細胞中的表達降低，可激活Wnt信號通路，引發牙周膜上的成骨干細胞分化不全，骨質降低。其他研究[15]發現CP組齦溝液中DKK1濃度高于對照組，且隨著牙周的發展，DKK1的分泌亦增加，提示DKK1與慢性牙周炎的發生發展相關。本研究結果顯示，輕度CP組的DKK1陽性積分值、蛋白表達水平高于正常組，重度CP組高于輕度CP組。查閱資料可知DKK1可以作為Wnt通路的抑制劑，能有效抑制骨形成，促進破骨細胞作用導致骨的破壞。DKK1蛋白在骨的代謝中扮演非常重要的作用。這也提示此蛋白在牙周炎發展過程中，面臨牙槽骨缺損流失的可能作用機制是與它可以抑制Wnt通路有關。其他實驗[16]在健康對照組齦溝液中亦檢測到少量的DKK1蛋白，說明DKK1也參與牙齦正常生理狀態的維持。

綜上所述，本研究通過免疫組織化學試驗檢測慢性牙周炎患者牙齦組織中SFRP1和DKK1的表達，結果表明兩者蛋白表達均高于健康對照組，且重度CP組高于中度CP組。SFRP1和DKK1蛋白表達與抑制Wnt通路有關，體內SFRP1和DKK1蛋白高表達可能會引起牙周炎的牙槽骨損害。