誘導痰CTGF mRNA、炎性因子及肺功能與呼吸窘迫綜合征早產兒危險分級及預后的相關性分析

吉翔，秦巧稚，孫雪，華蕓

(1.江蘇省揚州市第二人民醫院·蘇北人民醫院北區醫院檢驗科; 2.江蘇省蘇北人民醫院兒科，江蘇 揚州 225007)

呼吸窘迫綜合征為一種常見呼吸系統疾病，由非心源性肺水腫引起，其主要表現為呼吸窘迫及低血氧癥，并且其發病急，且患兒病程進程較快，具備較高發病率及死亡率，對新生兒生命安全造成嚴重威脅[1-4]。而早產兒肺部組織發育不完全，故缺乏足夠肺表面活性物質，則更易發生呼吸窘迫綜合征。患兒發病后，其肺血管內皮通透性及血管外肺水增加，則造成機體炎性因子大量被釋放，從而將進一步加劇患兒病情。其次，患兒發病后，臨床表現為進程性呼吸困難，則患兒肺功能將受到影響。另外，有研究表明結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)為參與氣道重塑關鍵因素，并且患兒患病后，則將造成CTGF mRNA水平上升[5]。故本次研究將探討誘導痰CTGF mRNA、炎性因子及肺功能對呼吸窘迫綜合征早產兒危險分級及預后的相關性分析，以期改善患兒預后。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年10月至2022年4月在江蘇省蘇北人民醫院就診的患呼吸窘迫綜合征早產兒80例，分為輕度組(n=28)、中度組(n=38)及重度組(n=14)，同時根據患兒預后狀況劃分為預后良好組(n=56)及預后不良組(n=24)。納入標準：(1)患兒家屬知情同意；(2)患兒為早產兒；(3)符合呼吸窘迫綜合征診斷標準；(4)急性起病。排除標準：(1)患有先天性肺部疾病；(2)患有其他免疫系統疾病；(3)中途轉院而缺乏臨床結果者。診斷標準參考《新生兒急性呼吸窘迫綜合征"蒙特勒標準(2017年版)》[6]：(1)明確或出現可疑臨床損傷后，1周內急性發作；(2)排除患兒因先天畸形引發的呼吸困難；(3)經肺部影像學分析，呈現雙側彌散性不規則透明度降低、滲出或白肺；(4)經心臟超聲，排除因先天性心臟疾病引發的肺水腫；(5)患兒出生24 h內出現呼吸窘迫癥狀。根據患兒氧合指數進行癥狀程度劃分[4]：(1)輕度：患兒氧合指數≥201 mmHg且≤300 mmHg；(2)中度：患兒氧合指數≥101 mmHg且≤200 mmHg；(3)重度：患兒氧合指數≤100 mmHg。預后良好：患兒經治療后癥狀減輕或恢復正常；預后不良：患兒經治療后癥狀未發生變化或持續加重。收集性別、胎齡、圍產期是否窒息、是否發生溶血、預后情況、生產方式、二氧化碳分壓、動脈血氧分壓、是否為高齡孕婦、是否發生妊娠高血壓及是否發生妊娠糖尿病等一般資料。見表1。研究經本院倫理委員會批準同意下進行。

表1 各組一般資料比較

1.2 方法

1.2.1 前期準備誘導痰 選用3%高滲氯化鈉溶液，對納入所有患兒進行霧化操作，操作時間15 min；隨即采用礦泉水對患兒進行漱口操作，直至患兒咳出痰液；將痰液收集，并置于消毒平皿中，做好標記后置于4 ℃下保存備用；將備用痰液取出，采用Eppendorf移液槍移取其中透明且濃度較高溶液，隨后加入0.1%二硫蘇糖醇試劑，加入量為所取痰液量的4倍；充分震蕩后，在37 ℃恒溫水浴加熱10 min，隨即過濾；靜置后離心15 min，3 000 rpm，取上清液置于-80 ℃下保存備用。

1.2.2 檢測方案及指標 采用RT-qPCR法檢測CTGF mRNA：取出備用上清液，采用總RNA提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，貨號：R1200)進行總RNA提取操作，并采用微量紫外分光光度計測量總RNA純度及濃度；若濃度>4 μg/mL，且D260/280為1.8～2.0，則所取總RNA符合測量標準；隨即進行逆轉錄操作，采用M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司，貨號：GS0147)，在42 ℃下反應50 min，隨即以RNA為模板進行逆轉錄操作，從而合成cDNA，隨即在70 ℃下反應70 min，并終止反應；隨后進行PCR擴增，產物長度213 bp，正向引物(5′-3′)：CACCGCACAGAACCACCACAC，反向引物(5′-3′)：GGCAGGCACAGGTCTTGATGAAC，擴增條件：先于95 ℃下預變熱3 min，隨后再于94 ℃下變性20 s，之后于56 ℃下退火40 s，并延伸30 s，重復次操作39個循環；經3次PCR操作后，取其平均值。以GAPDH為內參，采用2-△△Ct法計算CTGF mRNA相對表達量。

炎性因子檢測：收集所有患兒空腹靜脈血3 mL，靜置后離心10 min，3 000 rpm，隨即收集上清液置于-30 ℃下保存備用；取出待測上清液，采用BS-1101 ELISA酶標分析儀(臨沂正衡化玻儀器有限公司)測定人轉化生長因子β1(TGF-β1)含量：取酶標包被板進行標準液稀釋，并設置空白孔及待測樣品孔后加樣，隨后進行溫育、配液及洗滌操作，完成后，除空白孔外均加入酶標試劑，再次溫育及洗滌后，加入顯色劑，避光顯色15 min后加入終止液，15 min后采用酶標分析儀檢測450 nm處吸光度值。白細胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF-α)用ELISA測量試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司)測量。

肺功能測量：采用耶格肺功能儀PAED(上海醫療設備有限公司)檢測所有納入患兒達峰時間(TPTEF)、達峰容積比(VPEF/VE)及呼吸峰流速(PEF)，給予患兒經鼻間歇正壓通氣，并在初始參數中將吸入氧濃度設為0.20%～0.30%，呼吸頻率為40～60次/min，吸氣時間為0.40 s，呼氣末正壓為0.392～0.588 kPa。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 各組患兒CTGF mRNA及炎性因子水平比較

CTGF mRNA、TGF-β1、TNF-α及IL-6在組間比較，水平從高到低依次為重度組、中度組及輕度組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組患兒CTGF mRNA及炎性因子水平比較

2.2 各組患兒肺功能情況比較

TPTHE、VPEF/VE及PEF在組間比較，水平從高到低依次為輕度組、中度組及重度組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組患兒肺功能情況比較

2.3 不同預后患兒各指標水平比較

預后良好組與預后不良組相比，CTGF mRNA、TGF-β1、TNF-α及IL-6較低，TPTHE、VPEF/VE及PEF較高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 不同預后患兒各指標水平比較

2.4 相關性分析

根據患兒病癥不同程度進行賦值，輕度為1，中度為2，重度為3，隨即進行Spearman相關性分析。CTGF mRNA、TGF-β1、TNF-α及IL-6與病癥程度呈正相關(rCTGF mRNA=0.800，rTGF-β1=0.353，rTNF-α=0.256，rIL-6=0.342，均P<0.05)，TPTHE、VPEF/VE及PEF與病癥程度呈負相關(rTPTHE=-0.598，rVPEF/VE=-0.432，rPEF=-0.385，均P<0.05)。

2.5 ROC曲線分析

根據患兒不同預后狀態進行賦值，預后良好為0，預后不良為1，隨即進行ROC曲線分析。ROC結果顯示，CTGF mRNA、TGF-β1、TNF-α、IL-6、TPTHE、VPEF/VE及PEF曲線下AUC面積分別為0.784、0.878、0.813、0.827、0.750、0.776及0.783，靈敏度和特異度分別為1.000和0.554、1.000和0.714、0.875和0.643、0.708和0.857、0.607和0.958、0.661和0.875、0.536和0.958。見表5。

表5 ROC曲線分析

2.6 影響患兒預后單因素分析

單因素分析結果顯示，預后良好組CTGF mRNA、TGF-β1、TNF-α、IL-6、TPTHE、VPEF/VE、PEF及胎齡與預后不良組相比，差異有統計學意義(P<0.05)。見表6。

表6 影響患兒預后單因素分析

2.7 影響患兒預后多因素分析

以患兒預后狀況最為因變量，進行賦值：預后良好為0，預后不良為1；以CTGF mRNA、TGF-β1、TNF-α、IL-6、TPTHE、VPEF/VE、PEF及胎齡作為協變量，進行Logistics回歸分析。Logistics分析結果得出，TGF-β1、TNF-α、IL-6及胎齡為影響患兒預后的主要因素。見表7。

表7 影響患兒預后多因素分析

3 討論

呼吸窘迫綜合征為新生兒中較常見的臨床危重癥，患兒主要表現為呼吸困難等臨床癥狀，且該疾病發生率較高，同時致死率可達13.5%～21.7%，嚴重威脅我國新生兒生命安全[7-8]。患兒發生呼吸窘迫綜合征病因較多，其中以患兒肺部表面活性物質不足、肺不張及肺部發育不完整為主要病因[9]。有研究[10]表明，呼吸窘迫發病機制與機體炎癥反應有關。該疾病為一種臨床綜合征，故在臨床上較難與其他疾病鑒別區分，因此對呼吸窘迫綜合征進行有效鑒別，并對疾病程度進行區分，為臨床治療的重要舉措。

誘導痰檢測為一種安全有效的氣道炎癥評價方法，且機體對誘導痰影響較小，故適用于新生兒疾病檢測[11]。CTGF為一種基質細胞蛋白，可促進或加速纖維化或病理性氣道重塑，故患兒發生呼吸窘迫綜合征時，其水平在機體內有所升高，而CTGF mRNA作為CTGF轉錄模板，其水平亦隨之升高[12-13]。患兒發生呼吸窘迫后，機體內將釋放大量炎性因子。有研究[14]表明，TGF-β1作為一種趨化因子，可加劇患兒肺部炎癥及纖維化進程，進而造成患兒發生呼吸窘迫。TNF-α為一種多效應細胞因子，若過量表達，則會引起嚴重炎性反應。IL-6為一種促炎因子，可導致肝臟分泌急性蛋白，從而引起急性炎癥反應。此外，患兒發病時，將出現呼吸困難等癥狀，究其原因為患兒肺部功能受限，TPTHE、VPEF/VE及PEF為肺部功能相關指標，可反饋患兒肺部功能狀況，對患兒疾病程度診斷具有一定鑒別意義[9]。

本研究結果顯示，CTGF mRNA、TGF-β1、TNF-α及IL-6在組間比較，輕度組水平均最低，重度組水平均較高，分析原因可能為病癥程度較重患兒，其肺部組織損傷程度較高，故機體釋放大量CTGF mRNA以進行氣道重組，同時重度病癥患兒因組織受損程度較高，則機體內炎癥反應程度強烈，從而表現為TGF-β1、TNF-α及IL-6水平較高，該結果與盧玉朱等[9,15-16]研究結果相似。其次，TPTHE、VPEF/VE及PEF在組間比較，輕度組水平均最高，重度組水平均最低，并且該類指標水平越高，表明患兒肺功能越好，分析原因可能為重度病癥患兒肺部損傷程度較高，故對患兒呼吸功能造成影響，則表現為TPTHE、VPEF/VE及PEF等肺功能指標水平較低。許冬梅等[17]研究亦表明，患兒病癥程度越低，其各項肺功能指標水平越高。另外，預后良好組與預后不良組相比，CTGF mRNA、TGF-β1、TNF-α及IL-6較低，TPTHE、VPEF/VE及PEF較高，該結果表明該類指標與患兒預后有一定關聯，并且患兒預后越差，其CTGF mRNA及炎性因子水平越高，肺功能越低。同時，Spearman相關性分析顯示，CTGF mRNA、TGF-β1、TNF-α及IL-6與患兒病癥程度呈正相關，TPTHE、VPEF/VE及PEF與患兒病癥程度呈負相關，說明該類指標可對患兒疾病程度進行一定反饋，其中CTGF mRNA、TGF-β1、TNF-α及IL-6水平隨患兒疾病程度加重而升高，TPTHE、VPEF/VE及PEF則隨患兒疾病程度加重而降低。另一方面，ROC結果顯示，CTGF mRNA、TGF-β1、TNF-α、IL-6、TPTHE、VPEF/VE及PEF曲線下AUC面積均高于0.70，提示該類指標用于預測患兒預后有較好價值。此外，Logistics分析結果得出，TGF-β1、TNF-α、IL-6及胎齡為影響患兒預后的主要因素，分析原因可能為炎癥反應程度較深，則對患兒機體損傷程度大，而新生兒自我修復能力較弱，則易發生不良結局，同時胎齡較小患兒可能存在機體發育不全等問題，相對于正常胎齡新生兒，其身體更孱弱，則更易發生疾病或疾病程度更易加重。故對于炎性反應程度較高患兒，應積極進行抗炎措施，以期改善患兒預后，并加強對胎齡較小患兒的日常監測，以提前治療或避免發生不良結局。

綜上所述，誘導痰中CTGF mRNA、TGF-β1、TNF-α、IL-6、TPTHE、VPEF/VE及PEF不僅可較好評估患呼吸窘迫綜合征早產兒病癥危險程度，亦可用于對患兒不良預后進行合理預測，具備較高應用價值。本研究尚存有不足之處，所選病例較少，故研究結果可能存在偏倚，下次研究將擴大所選樣本量，以期深入研究。