IL-15與NK細胞在不明原因復發性流產中的臨床意義

谷秀霞，林寧，戴凌，李曉紅，趙琳

(南京醫科大學附屬蘇州科技城醫院婦產科，江蘇 蘇州 215000)

復發性自然流產(recurrent spontaneous abortion，RSA)在臨床指婦女妊娠期出現連續兩次或超過兩次的自然流產現象，是育齡期女性較易見病癥之一，而導致RSA產生原因與父母染色體存在異常、內分泌嚴重失調、子宮內膜感染及子宮的結構存在異常等有關，且這些原因在RSA中占40%～50%；而其余50%～60%的RSA原因還未明確。在患者再次妊娠期間出現自然流產風險較大時臨床統稱不明原因復發性流產(unexplained recurrent abortion，URSA)，嚴重影響女性生殖健康[1-2]。絨毛膜促性腺激素β(human chorionic gonadotropin-β，HCG-β)與孕酮是臨床評估產婦是否存在先兆流產風險的常規指標，其中HCG-β為胎盤滋養層的細胞分泌而得糖蛋白類激素，有效保持產婦黃體，并減少產婦淋巴細胞相關功能對胎兒造成排斥反應，是女性妊娠期特異性標志[3]；孕酮為妊娠早期機體必需的孕激素，具有顯著生物活性，其能減少妊娠期產婦子宮遭受外界刺激敏感度，繼而降低子宮收縮現象[4]。但近年來研究[5]發現，HCG-β與孕酮水平易遭到諸多因素影響，使得鑒別診斷價值欠佳。因此，臨床學者對尋找更具診斷價值的指標十分關注。自然殺傷(natural killer，NK)細胞為人體防御體系的首層屏障，NK細胞具備機體監視功能，通過分泌大量細胞因子及細胞毒性免疫等途徑產生免疫調節[6]。白細胞介素-15(Interleukin-15，IL-15)被認為是維持NK細胞在機體中存活、增殖及分化所必需的細胞因子[7-8]。對于外周血IL-15與NK細胞的相關性臨床研究尚少。本研究擬觀察URSA患者的外周血IL-15與NK細胞亞群水平的改變，并分析其檢測臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月至2019年12月就診于南京醫科大學附屬蘇州科技城醫院婦產科計劃生育門診及婦科門診的URSA患者57例為研究對象(觀察組)；并選取同期入院體檢，且無不良孕產史的健康早孕者57例為對照組。兩組一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。對照組納入標準：(1)既往有生育出足月且健康的胎兒；(2)早孕等臨床反應均正常。觀察組納入標準：(1)通過排除性診斷篩查[9]，排除如子宮解剖結構因素、患者血栓前狀態、遺傳因素、內分泌因素、感染因素、免疫因素及其他不良因素等病因，無法確定上述病因的復發性流產患者，且已完善婦科相關檢查；(2)既往出現超過兩次自然流產癥狀；(3)夫妻雙方未出現染色體異常；(4)患者及其家屬均知情同意。排除標準：(1)自身存在免疫性相關病癥；(2)伴發心肝腎等重大疾病；(3)遺傳性病癥；(4)合并其他嚴重病癥；(5)臨床相關資料不齊等。本研究已獲得南京醫科大學附屬蘇州科技城醫院醫學倫理委員會批準，所有患者對研究內容知情同意。

1.2 方法

全部的受試者在檢查的前1 d天飲食保持少鹽、少脂肪，維持睡眠充分且均禁煙酒；于此日的清晨空腹采集8 mL的靜脈血，在2 000 rpm下離心15 min，并放置-80 ℃待測。

ELISA檢測血清IL-15、孕酮、HCG-β、TNF-α、VEGF和CCL5水平：酶聯免疫分析儀(型號：AMR-100/100T；廠家：杭州奧盛)檢測血清IL-15(型號：YY-Es-11497；廠家：德國IBL)、孕酮、HCG-β、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、血管內皮生長因子(VEGF)及趨化因子配體5(CCL5)(均購自武漢賽培生物)水平。實驗步驟嚴格按照操作說明書進行操作。

流式細胞儀檢測外周血單個核細胞(PBMC) NK細胞亞群：(1)FICOLL密度的梯度分離法對外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)進行提取，選用無熱源的人淋巴細胞分離液(含葡聚糖、蒸餾水及泛影葡胺成分，廠家：美德太平洋生物)制作出1～2×106個/mL細胞懸液；(2)超凈臺在進行實驗前30 min實施紫外消毒，低溫待檢分離液放置到室溫溫度后再行實驗，室溫需控制低于24 ℃，全部標本需于3 d里完成檢測；(3)流式細胞儀(型號：EPICS-XL；廠家：美國Beckman Coulter公司)對PBMC懸液里NK細胞亞群(CD56+CD16+、CD56+CD16-、CD56-CD16+)(試劑盒貨號：BNCC339975；廠家：北京北方偉業計量技術研究院)檢測。流式細胞儀實驗步驟：取一定量細胞(約1×106個/mL)，直接加入連接有熒光素的抗體進行免疫標記反應，孵育20～60 min后，用PBS(pH7.2～7.4)洗1～2次，加入緩沖液重懸，上機檢測。(4)BD FACSAnto軟件進行自動化質量控制，選擇 BD FACSDiva軟件獲得10 000個細胞，前向角散射光(forward scatter,FSC)對細胞碎片的干擾進行排除，用FSC/SSC圖以圈出所檢淋巴細胞，通過散點圖對細胞亞群比例加以分析，最后再用BD FACSDiva軟件進行計算。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 兩組一般資料比較

兩組觀察組與對照組年齡、體重指數(BMI)、體重、孕囊大小、孕周、染色體異常占比、黃體功能不全占比、內分泌異常占比、吸煙及酗酒比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，觀察組子宮異常占比、高凝狀態占比高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 兩組血清孕酮、HCG-β及IL-15水平比較

觀察組血清孕酮及HCG-β水平低于對照組，IL-15水平高于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 兩組孕酮、HCG-β及IL-15水平比較

2.3 兩組NK細胞水平比較

觀察組CD56+CD16+型NK細胞水平高于對照組，CD56+CD16-與CD56-CD16+型NK細胞低于對照組(P<0.05)。見表3。

表3 兩組NK細胞亞群比較

2.4 外周血IL-15與NK細胞各個亞群水平的相關分析

外周血IL-15水平和CD56+CD16+型NK細胞水平呈正相關性(r=0.560，P<0.05)；和CD56+CD16-、CD56-CD16+型NK細胞水平呈負相關性(r= -0.641、-0.571，P<0.05)。見圖1。

2.5 外周血IL-15與NK細胞診斷URSA效能

外周血IL-15與NK細胞的三種亞型比例對URSA的發生均有診斷學價值(AUC=0.680～0.927，P<0.05)；4個指標聯合診斷的AUC可達到0.942，高于任意一項指標的單獨診斷效能(Z=6.524、16.325、11.700、6.052，P<0.05)。見表4。

表4 外周血相關指標診斷URSA效能

2.6 血清TNF-α、VEGF與CCL5水平比較

觀察組血清TNF-α、VEGF、CCL5水平高于對照組(P<0.05)。見表5。

表5 兩組TNF-α、VEGF與CCL5水平比較

3 討論

RSA患者在妊娠12周前，便能產生腹痛與陰道流血等癥狀，通過超聲等檢查可見患者胚胎發育低于正常孕周，其妊娠囊有所變形，未見胚芽，伴隨妊娠囊的位置朝下移動，呈現無原始心血管的搏動等影像學相關表現。諸多患者可能僅表現月經量異常增多或推遲。胎兒在母體中能被識別成同種異體的移植物，因其具有約50%父系相關遺傳物質，在母體中當作移植受體，可發揮出非我以及自我識別免疫系統的功能[10-11]。考慮到URSA病因較復雜，其出現和機體免疫相關指標存在緊密關系，故而通過分析免疫相關因素在URSA病發期間的作用對確定患者發病機制并進行盡早預防至關重要。基于此筆者對URSA患者的外周血IL-15與NK細胞亞群水平的改變進行觀察，發現伴隨外周血IL-15水平提升，NK細胞的毒活性隨之增多，繼而引發患者流產癥狀。

有研究[12]發現，在正常女性不同的月經周期檢測子宮內膜皆存在IL-15表達，而子宮內膜里IL-15含量RSA患者更高，且IL-15變化和臨床常規檢查具備相似檢測結果。本研究中URSA患者孕酮與HCG-β水平低于正常產婦，而IL-15水平高于正常產婦，提示通過孕酮與HCG-β水平異常與否可確定患者是否存在流產風險，而IL-15在母胎界面出現異常表達和自然流產存在相關性。分析原因可能是在正常妊娠時IL-15適量表達能有效維系妊娠期間免疫系統的平衡性，但IL-15呈現過量表達可能對胎兒與滋養層細胞造成細胞毒相關效應，使機體免疫受損，對患者胚胎順利著床與后續發育產生影響，從而導致流產癥狀。NK細胞來源至今尚未完全確定，常認為其直接由骨髓所衍生，且其在淋巴結與骨髓里的表達遠少于外周血，是機體中固有的一類免疫系統細胞，其活化無需通過抗原的刺激，能直接產生細胞毒相關效應，可在人體中發揮抗腫瘤、病原菌的殺滅等重大功效[13]。妊娠早期NK細胞會分泌諸多細胞因子，并參與子宮內胎盤的小血管重塑，繼而對女性正常妊娠加以保護。NK細胞CD56+CD16-型可保護并在胚胎的發育期間提供營養；適量的CD56-CD16+型可抵御女性妊娠期間出現微生物的感染，而過量則能對其胎兒造成排斥反應；CD56+CD16+型能激活細胞的毒效應，產生非特異性的靶細胞殺傷能力；當這三類亞型失衡時，殺滅妊娠相關有害物質的同時，對胚胎產生排除傷害，導致妊娠失敗[14]。本研究中觀察組CD56+CD16+型NK細胞水平高于對照組，觀察組CD56+CD16-與CD56-CD16+型NK細胞水平低于對照組。說明CD56+CD16+型數量異常增加，CD56+CD16-與CD56-CD16+型異常減少，繼而導致URSA。正常妊娠期間，殺傷性的抑制受體水平提高，能阻擋殺傷信號的傳遞，使NK細胞的殺傷功能關閉，繼而有效維持妊娠；當NK細胞的毒性增加時，會致使妊娠失敗的不良結局出現。

T淋巴細胞為機體免疫耐受中關鍵性介質，依照其表面不同分化簇，可分成抑制性的T細胞與輔助性Th細胞，而Th細胞又因所介導功能不同分Th1與Th2細胞亞群，IL-15歸屬于Th1型的細胞因子，IL-15為NK細胞的特異性促成熟因子，臨床可見NK細胞上存在IL-15受體表達[15]。有研究[16]證實，腫瘤的發生期間NK細胞活化主要由IL-15反式信號所轉導的細胞影響，其觸發NK細胞約8 h至外周血，進而到達機體腫瘤組織的相應部位，再由其余活化信號產生協同作用來構成效應細胞。本研究顯示，URSA患者外周血IL-15水平和NK細胞CD56+CD16+型呈正相關性，和CD56+CD16-、CD56-CD16+型負相關性；外周血IL-15與NK細胞聯合檢測診斷URSA效能最優。提示IL-15水平隨著NK細胞CD56+CD16+型水平的上升而增加，IL-15與NK細胞聯合檢測有助臨床URSA疾病診斷和鑒別。可能是因IL-15表達增加致使NK細胞中能激活細胞毒活性的CD56+CD16+型增多，引發機體免疫過量激活，導致免疫耐受異常，進而致使患者流產等不良妊娠結局。腫瘤發展期間NK細胞能通過內識別法對機體細胞活化進行直接識別，通過IL-15等直接接觸因子或TNF-α等能溶性因子傳遞信號到機體NK細胞，使其發揮炎性因子分泌以及殺傷功效[17]。

女性孕早期血清IL-15水平能對NK細胞的增值產生促進，繼而使NK細胞生成包含TNF-α在內的一系列相關炎癥因子，在妊娠早期TNF-α能促進產婦能量代謝、降解細胞的外基質以及維系黃體功能，通過調節機體滋養層細胞來影響血清孕酮、HCG-β等激素水平[18-19]。而妊娠期NK細胞可產生VEGF等生成血管的前因子，能對血管的重塑構成誘導，形成產婦胎盤區域的血管，繼而為產婦與胎兒供給血液[20]。同時，NK細胞能分泌CCL5等趨化因子，而此類趨化因子能利用自分泌以及旁分泌有效調控機體免疫活性以及滋養層細胞功能，進而產生妊娠的免疫耐受，使妊娠成功[21]。本研究顯示，觀察組血清TNF-α、VEGF、CCL5水平高于對照組。提示TNF-α參與機體滋養層細胞浸入及分化等功能的調節，流產癥狀產生可能和TNF-α、VEGF與CCL5水平增加相關。臨床可通過輔助診斷NK細胞下游介質TNF-α、VEGF、CCL5水平變化為早期診斷URSA提供參考。分析原因TNF-α的高表達令母胎界面的免疫失衡，進而介導機體排斥胚胎細胞相關免疫反應，并對子宮的平滑肌相關組織產生興奮，引發子宮收縮，進而使胎盤的滋養層處血管遭受損傷，產生炎癥血栓，繼而對胚胎的植入以及發育形成阻礙；而VEGF水平異常會影響胎盤的絨毛血管正常生長，導致產婦流產；CCL5能募集許多活化Thl型淋巴細胞到蛻膜，而這些活化Thl型細胞會再分泌CCL5，形成級聯增大的作用，繼而產生免疫效應，其水平上調導致母胎界面Thl型水平的紊亂，導致產婦出現自然流產。

綜上，外周血IL-15與CD56+CD16+型NK細胞水平呈正相關，檢測外周血IL-15水平高表達及NK細胞亞群明顯失衡可作URSA有效診斷指標。但本研究由于病例數較少，具有局限性，仍需更多樣本檢測加以證實。