CST6在結腸癌中的表達及與腫瘤血管生成的關系

吳德俊 徐安軍 余 波

（1上海市浦東醫院-復旦大學附屬浦東醫院胃腸外科，2血管外科 上海 201399；3上海市血管病變調控與重塑重點實驗室 上海 201399；4復旦大學附屬華山醫院血管外科 上海 200040）

結腸癌是嚴重威脅人類生命健康的疾病。根據2020年數據顯示，全球范圍內約有110萬人被診斷為結腸癌，是第四大常見腫瘤，全年約57萬人因其死亡［1］。中晚期結腸癌的治療方式包括手術、放療、化療、靶向治療在內的綜合治療。但是，因早期結腸腫瘤狀不明顯，發現困難，我國大部分結腸癌患者初診時已經處于中晚期。外科手術和放化療等治療方式盡管能在一定程度上消滅腫瘤、遏制進展，但是腫瘤的復發和轉移率仍然很高，是結腸癌治療的難點［2］。因此，闡明結腸癌發生、發展的分子機制，篩選出與結腸癌侵襲轉移相關的指標用于指導臨床治療和預測疾病預后，對結腸癌診治意義重大。

CST6基因位于染色體11q13［3］，其所編碼的蛋白是半胱氨酸蛋白酶抑制因子Cystatin 6（CST6）（又名cystatin M/E）［4］，屬于半胱氨酸蛋白酶抑制劑家族（Cystatins）成員。研究表明表明CST6編碼的蛋白cystatin M/E在多種腫瘤進展中具有不同的功能效應［5］。在黑色素瘤、宮頸癌、腦癌、前列腺癌、胃癌和腎癌中產生抑癌作用，因此被認為是具有預后意義的生物標志物。同時，在口腔癌［6］、胰腺癌［7］、甲狀腺癌［8］和肝癌［9］中，發現CST6具有腫瘤促進作用。但是CST6在結腸癌中的表達及其與結腸癌患者的預后關系尚不清楚。

本研究利用腫瘤基因組圖譜數據庫（The Cancer Genome Altas，TCGA），分析CST6在正常結腸上皮和結腸癌中的表達差異，并探討其表達高低與結腸預后的關系。同時，采用基因富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA），探究CST6在腸癌中可能影響的信號通路及相關分子，并進一步在臨床結腸癌樣本中通過免疫組化方法進行驗證。旨在探索CST6在結腸癌中的作用及作為結腸癌預后的新型標記物的可能性。

資料和方法

公共數據獲取與差異分析可開放獲取的結腸癌患者數據從TCGA中下載，包括41個正常樣本473個腫瘤樣本的轉錄譜及臨床數據。TCGA數據庫是由美國國家腫瘤研究所（National Cancer Institute，NCI）和國家人類基因組研究所（National Human Genome Research Institute，NHGRI）合作建立的腫瘤研究項目，通過收集整理腫瘤相關的各種組學數據，提供了一個大型的免費的腫瘤研究參考數據庫。在TCGA數據庫中下載FPKM格式轉錄譜數據并使用perl語言整理成表達矩陣。使用參考基因組文件GRCh38.gtf進行探針注釋。使用limma進行數據標準化。患者臨床數據通過TCGA-GDC下載xml格式數據后使用perl語言整理，包括患者的預后信息、年齡、臨床分期等。KM曲線生存分析使用R語言的Survival包進行。

基因集富集分析GSEA是由Broad Institute研究所提出的一種富集方法。其不需要指定明確的差異基因閾值，根據實際數據的整體趨勢，在表達譜的整體層次上對不同分組的生物學通路進行富集。基于Hallmark癌通路基因集合，對高CST6和低CST6樣本的表達譜進行了GSEA通路富集。

組織樣本回顧性收集復旦大學附屬浦東醫院2021年1—12月的結腸癌組織手術標本45例，患者術前均未接受過化療或放療。組織標本均為我院病理科提供的石蠟標本，且均由病理科醫師做出診斷。研究獲得復旦大學附屬浦東醫院倫理委員會批準（倫理批號：2020WZ-018）。所有患者均在術前簽署知情同意書，同意將個人的臨床、病理資料和手術標本用于科學研究。

免疫組織化學染色將組織芯片置于二甲苯中脫蠟，并經無水乙醇、85%和75%乙醇梯度水化。組織切片放入檸檬酸抗原修復緩沖液（pH=6.0）中煮沸，進行抗原修復。之后放入3%雙氧水溶液阻斷內源性過氧化物酶，再以3% BSA行血清封閉。CST6一抗（美國Proteintech公司，17076-1-AP，濃度1∶100）、PDGFR一 抗（美 國Abcam公 司 ，ab32570，濃度1∶400）及E-Cadhein一抗（美國CST公司，3195，濃度1∶400）4℃孵育過夜。再滴加適量辣根過氧化物酶標二抗聚合物，室溫孵育50 min。后DAB顯色、蘇木精復染、脫水封片。利用自動掃描顯微鏡和圖像采集分析系統拍攝免疫組化染色照片。讀片由病理科醫師獨立完成，讀片前后均不告知患者的任何信息，讀片標準為：（1）目的蛋白染色陽性定義為≥5%腫瘤細胞的胞質內可見棕褐色染色；（2）染色強度評分計0～3分，0分為陰性，1分為弱陽性，2分為中度陽性，3分為強陽性；（3）染色范圍評分計0～4分，0分為＜5%，1分為5%～24%，2分為25%～49%，3分為50%～74%，4分為75%～100%。最后綜合表達評分（composite expression score，CES）為染色強度評分×染色范圍評分。

統計學分析所有的統計分析均在R語言、SPSS 19.0和GraphPad Prism 8中完成。符合正態分布的數據使用Student’st檢驗比較差異。非正態分布的數據使用Wilcoxon秩和檢驗。兩連續性變量相關性使用Pearson檢驗計算相關系數。雙側P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

CST6在結腸癌中的表達首先在結腸癌患者癌組織和正常結腸上皮組織中探究CST的表達情況。選取TCGA數據庫中包括41個正常和473個腫瘤樣本的轉錄譜及臨床數據進行研究，我們發現CST6在結腸癌組織中的表達顯著高于正常結腸上皮組織（圖1A）。進一步對比CST6在轉移性結腸癌和無轉移結腸癌的表達情況，選取的數據集包含了61例明確存在轉移的結腸癌和330例明確無轉移結腸癌患者的表達數據，結果表明CST6在轉移性結腸癌組織中的表達顯著高于無轉移結腸癌組織，提示結腸癌中CST6可能作為一種癌基因影響著結腸癌的發生發展（圖1B）。

圖1 CST6在TCGA數據庫結腸癌樣本中的表達Fig 1 The expression of CST6 in colon cancer samples of TCGA

CST6表達與結腸癌預后的關系為進一步明確CST6在結腸癌中的作用，我們對CST6不同表達的結腸癌患者進行了生存分析，包括總生存（overall survival，OS）、疾 病 特 異 性 生 存（disease specific survival，DSS）以 及 無 進 展 生 存（progress free survival，PFS）。結果表明，相比較于CST6低表達水平的患者，CST6高表達的患者具有更差的DSS（HR=1.63；95%CI：1.02～2.70；P=0.043；最 高229例，最低228例）。然而，結腸癌組織中CST6的高表達并未能顯著影響OS及PFS（P＞0.05，圖2A～C）。上述結果表明，CST6能夠影響結腸癌的轉移過程。

圖2 TCGA數據庫樣本中CST6表達高低與結腸癌患者OS、DSS和PFS的關系Fig 2 The association of CST6 expression with the survival of patients with colon cancer in TCGA samples

CST6相關信號通路分析為探究CST6在結腸癌中的作用機制，我們進而對CST6不同表達的結腸癌患者進行了基于Hallmark基因集的GSEA分析，結果表明，CST6影響的通路主要富集在結腸癌血管生成和上皮間質細胞轉化信號通路（圖3）。這兩個通路在促進結腸癌轉移方面發揮著重要作用。分子相關性結果表明CST6和調控血管生成的關鍵分子血小板衍生生長因子受體（plateletderived growth factor receptor，PDGFR）存在顯著正相關（圖4A），而與VEFGR無顯著相關性（圖4B），提示CST6可能參與調控PDGFR的表達，進而影響血管生成過程促進結腸癌轉移。對于上皮-間質細胞轉化信號通路，我們發現，結腸癌組織中CST6與上皮標志物E-Cadherin無顯著相關性（圖4C），但與間質標志物N-Cadherin及Vimentin表達呈現顯著的正相關（圖4D、E），提示CST6可能參與調NCadherin及Vimentin的表達，進而影響上皮-間質細胞轉化信號促進結腸癌轉移。

圖3 GSEA分析CST6低表達和CST6高表達的結腸癌組織間基因富集差異Fig 3 GSEA between cancers with high CST6 expression and cancers with low CST6 expression

圖4 數據庫分析結腸癌中CST6與血管生成分子及上皮-間質標志物表達的相關性Fig 4 Database analysis of the correlation between CST6 and the expression of angiogenesis-related factors and epithelial-mesenchymal transition markers in colon cancer

CST6相關信號分子驗證為進一步在人腸癌組織中驗證CST6的表達，及其與PDGFR和NCadherin表達的相關性，我們取45例本院結腸癌患者臨床樣本進行免疫組化檢測及定量分析。結果表明，CST6在結腸癌組織中表達顯著升高，高于配對癌旁組織（P＜0.05，圖5A、B），與圖1中的TCGA數據庫結論一致。結腸癌組織中CST6、PDGFR、N-Cadherin均呈現較高表達（圖5A）；采用Spearman相關性分析顯示，CST6表達與PDGFR表達呈現顯著的正相關性（r=0.604 1，P＜0.001，圖5C），同時CST6表達與N-Cadherin表達也呈正相關（r=0.629 8，P＜0.001，圖5D），進一步證實了上述數據庫生信分析的結論。

圖5 臨床腸癌組織樣本中驗證CST6的表達及其與和PDGFR和N-Cadherin表達的相關性Fig 5 The validation of CST6 expression and its correlation with PDGFR and N-Cadherin level in clinical colon cancer tissue samples

討 論

本研究利用TCGA數據庫，并結合GSEA分析發現CST6在結腸癌組織中的表達明顯高于正常結腸上皮；與CST6低表達的結腸癌患者相比，CST6高表達的結腸癌患者預后較差，更容易發生轉移；CST6在結腸癌組織中的高表達與血管生成及EMT信號通路顯著相關；CST6和血管生成相關信號分子PDGFR及間質標志物N-Cadherin的表達呈現顯著的正相關性，可能通過PDGFR調控腫瘤的血管生成及上皮-間質轉化過程，進而影響腸癌侵襲轉移。

CST6基因首先是從轉移性乳腺癌細胞中分離出來的，人類的完整序列CST6基因最早由Zeuween等［10］鑒定出來。CST6可能參與多種分子機制，對不同類型的腫瘤有不同的作用機制。對乳腺癌的研究發現浸潤性導管癌中CST6表達的cystatin M/E蛋白水平表達降低或缺失明顯，正常乳腺上皮細胞中主要定位于細胞質的cystatin M/E，在浸潤性導管癌組織中幾乎無陽性著色；并且cystatin M/E可顯著抑制乳腺癌細胞的侵襲及轉移能力［11］。CST6在嗜骨乳腺癌細胞和腫瘤樣本中下調。功能分析證實CST6在腫瘤侵襲和乳腺骨轉移中具有抑制作用［12］。CST6在非小細胞肺癌中表達降低，而高表達CST6可以抑制非小細胞肺癌細胞在體外培養中的生長［13］。在原發性宮頸腫瘤中存在CST6失活導致的cystatin M/E表達缺失，提示CST6是一種宮頸癌抑制因子［14］。可能與NF-κB信號通路調控及其核表達有關［15］。腦惡性膠質瘤中啟動子甲基化完全阻礙了膠質瘤起始細胞CST6的表達，而cystatin M/E的異常高表達降低了起始細胞CST6的能動性和侵襲性［16］。前列腺癌中，啟動子組蛋白修飾導致CST6下調，參與了前列腺癌浸潤和轉移期的進展［17］。對胃癌及其相鄰非腫瘤組織中CST6甲基化狀態的分析顯示，由于啟動子高甲基化，胃癌中CST6表達缺失。此外，CST6高甲基化患者的生存時間明顯短于啟動子低甲基化患者［18］。

除了其傳統的抑瘤作用外，CST6也可能起到抑瘤作用腫瘤促進效應。在三陰性乳腺癌中，CST6表達升高，且與高淋巴結轉移風險和低無病生存率相關，提示其可能是腫瘤促進分子［19］。對來自口咽鱗狀細胞癌原發灶和轉移灶的細胞株的分析表明，CST6在轉移灶中的表達比原發灶高40倍。CST6的上調可能通過阻斷固有的組織蛋白酶B的活性，從TNF-α誘導的凋亡中拯救腫瘤細胞而促進轉移［20］。在胰腺導管腺癌中，CST6可能通過抑制細胞內促凋亡的組織蛋白酶B參與胰腺癌的增殖和生存，并可能是胰腺腫瘤的啟動子［21］。甲狀腺乳頭狀癌中，CST6可能位于BRAF/MEK細胞外信號調節激酶信號通路的下游［22］。此外，CST6也與淋巴結轉移相關。生存分析顯示，CST6可以作為乙型肝炎病毒相關肝癌患者的預后標志物，CST6的高表達與患者的低生存率相關［23］。

我們的研究證實了CST6在結腸癌組織中呈高表達，高表達CST6的結腸癌患者預后差，提示其可能在結腸癌中發揮促癌基因的作用，并可能成為預測結腸癌患者預后的潛在分子標記物。在上述研究基礎上，我們還探索了與CST6表達相關的潛在信號通路。發現CST6高表達的結腸癌患者中，EMT和血管生成通路被顯著激活；結腸癌組織中CST6和PDGFR及N-Cadherin表達呈現顯著的正相關性。

既往文獻已經證實，結腸癌的發生發展與EMT和腫瘤血管生成密切相關。Yi等［24］綜合多組學分析發現，RUNX2通過與EMT相關的啟動子和/或潛在的增強子結合可以促進結腸癌的EMT效應，從而促進腫瘤轉移、干細胞化和治療抗性。研究發現，在結直腸癌中，WNT2在腫瘤相關成纖維細胞中選擇性升高，并通過調控促血管生成功能相關蛋白的升高，促進血管生成信號，從而促進腫瘤的進展［25］。Xu等［26］研究了CST6在多種腫瘤類型中的表達模式，發現CST6表達與上皮細胞浸潤參與EMT和增殖呈正相關。這與我們的研究結果相符。但是，探究結腸癌中CST6與血管生成的相關性，卻未見報道。

PDGFR是PDGFs／PDGFRs信號轉導 途 徑 中的重要成員，為一種單鏈跨膜糖蛋白，屬于III型酪氨酸蛋白激酶家族，分布于人體組織，如平滑肌細胞SMC、成纖維細胞、內皮細胞、神經膠質細胞核軟骨細胞等。研究表明，在結腸癌發展中，PDGFs／PDGFRs能促進腫瘤血管生成，促進腫瘤的進展［27］。我們發 現 ，結 腸 癌組織中CST6與PDGFR呈現正相關，但是，CST6是否可以通過影響PDGFs／PDGFRs通路調控結腸癌的惡性進展，有待分子生物學實驗進一步證實，這是本研究不足之處。此外，對于CST6在結腸癌預后中的作用，本研究目前僅通過TCGA數據庫的樣本進行研究，未進一步在本院臨床樣本中進行生存分析的研究及驗證，也是今后需要完善的內容。

本研究證實CST6是預測結腸癌預后的一個潛在分子標記物。未來可在細胞水平和動物實驗中進一步探索CST6的結腸癌發生發展中的功能和潛在分子機制。

作者貢獻聲明吳德俊 數據采集，論文撰寫和修訂。徐安軍 數據統計和分析。余波 論文構思和修訂論文。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。