血栓閉塞性脈管炎患者血漿源性外泌體miR-223-5p對人血管平滑肌細胞的影響

陳 波 林學廣 鄧 穎 王 博 童進東 余 波，3 史衛軍 湯敬東△

（1上海市浦東醫院-復旦大學附屬浦東醫院血管外科 上海 201399；2上海市血管病變調控與重塑重點實驗室 上海 201399；3復旦大學附屬華山醫院血管外科 上海 200040）

血栓閉塞性脈管炎（thromboangiitis obliterans，TAO）也稱為伯格病（Buerger disease），是一種節段性非動脈硬化性炎癥和閉塞性疾病，主要影響四肢的中小血管和神經［1］。TAO與煙草接觸密切相關，可能由于煙草接觸提高了患者體內的氧化應激水平 ，導 致 血 管 收 縮 ，TAO好 發 于 年 輕 吸 煙 者［2］。TAO患者10年和15年截肢率分別為26%和34%，戒煙可明顯降低截肢風險［3］。雖然TAO自發現以來已經過去了一個多世紀，但其發病機制尚無定論［4］。

外泌體是最小的膜囊泡，攜帶大量功能蛋白、mRNA和microRNA（miRNA）等，充當細胞間物質和信息交流的關鍵信使［5］。外泌體可以調節血管內皮細胞功能，抑制心臟損傷和促進心臟修復，在炎癥中發揮調節作用，具有治療炎癥性疾病的潛力［6-9］。循環外泌體miRNA可能是多種疾病的生物標記物和治療靶點，如終末期腎病［10］、心血管疾病［11］和幾種類型的癌癥［12-14］。外泌體可能通過調節炎癥、自身免疫、促凝血和內皮損傷/功能障礙參與血管炎的發病機制［15］。討論循環外泌體miRNA在TAO發病機制中生物學功能的研究較少。

我們研究了從TAO患者和配對正常對照受試者血漿中分離的外泌體miRNA表達譜，通過生物信息學分析鑒定出差異表達的miRNA（differentially expressed miRNA，DE-miRNA），探討其和TAO患者血漿源性外泌體對人血管平滑肌細胞（human vascular smooth muscle cell，HVSMC）的影響，以期了解TAO患者血漿循環外泌體在TAO發病過程中的分子機制。

材料和方法

細胞培養和處理HVSMC和HEK-T293細胞來自武漢大學細胞庫。HVSMCs在F12K培養基（21127022，美 國Gibco公 司）中 培 養 ，其 中 含 有10%FBS（16000-044，美國Gibco公司）和1%青霉素/鏈霉素（15140-122，美國Gibco公司）；HEKT293細 胞 在Dulbecco改 良 的Eagle培 養 基（11995500BT，美國Gibco公司）中培養，添加10%FBS和1%青霉素/鏈霉素。

血漿樣本采集血液樣本來源于2019年1—12月在復旦大學附屬浦東醫院診斷為TAO的3名患者和3名健康受試者，納入標準：50歲前出現癥狀，吸煙/吸煙史，無其他動脈粥樣硬化危險因素，上肢累及中等大小血管或淺表血栓性靜脈炎。隨機選取無血栓或動脈疾病史的年齡匹配的健康獻血者作為對照組。排除其他原因導致的外周動脈疾病，如動脈粥樣硬化、栓塞性血管閉塞、血脂異常、血管炎、創傷、放射性動脈炎、促凝狀態。本研究獲得浦東醫院倫理委員會批準（編號：wz-003），參與者均簽署知情同意書。

TAO患者和健康對照受試者各采集血樣10 mL，4℃下1 900×g離心10 min。接著，將懸浮液轉移到新的試管中，4℃下3 000×g離心15 min。-80℃下儲存懸浮液，用于分離外泌體。

外泌體分離和鑒定根據標準方案［16］，4℃下12 000×g超速離心30 min，分離提純血漿樣本中的外泌體。0.22 mm微孔膜過濾上清液，去除大膜泡。過濾后的上清液在4℃下120 000×g超速離心60 min，所 得 顆 粒 用10 mL PBS重 懸 ，4℃ 下120 000×g再次超速離心60 min。

使用NanoSight LM10-HS系統（NS300，英國馬爾文儀器有限公司）通過納米粒子跟蹤分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）評估外泌體的大小分布。在120 kV透射電子顯微鏡下（transmission electron microscope，TEM）（JEM-1230，美國Joel公司）觀察純化外泌體的形態［17-18］。5 μL外泌體懸浮液放置于銅網聚醋酸甲基乙烯脂涂層碳穩定格柵，10 min后用濾紙將殘留的懸浮液濾掉，向網格中添加2%磷鎢酸（10 mL，pH=6.5），室溫下染色2 min。

Western blot分析觀察前使網格干燥，Western blot檢 測CD63、CD9和CD81表 達。使 用RIPA蛋白裂解緩沖液（P0013B，上海碧云天生物技術有限公司）從獲得的外泌體中分離全部蛋白，使用BCA蛋白分析試劑盒（PL212989，武漢博士德生物工程有限公司）測量蛋白濃度。通過10% SDSPAGE分離蛋白質樣品（20 μg），轉移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）（IPVH00010，美國Millipore公司），37℃下用5%脫脂牛奶封閉2 h。分別用抗CD63抗體（A5271，美國ABclonal公司）、抗CD81抗體（ab109201，英國Abcam公司）、抗CD9抗體（ab92726，英國Abcam公司），抗鈣結合蛋白抗體（10427-2-AP，美國Proteintech公司）和抗白蛋白抗體（16475-1-AP，美國Proteintech公司）與PVDF膜共同孵育一夜。用磷酸鹽吐溫緩沖液（phosphate buffered saline Tween，PBST）洗滌3次，將膜與辣根過氧化物酶結合的山羊抗兔IgG（111-035-003，美 國Jackson Immuno Research公 司）在37℃下孵育2 h。PBST洗滌3次，使用微孔電化學發光系統觀察蛋白質條帶。

miRNA文庫的構建和測序根據標準方法，使用RNAiso Plus［9109，寶生物工程（大連）有限公司］從外泌體中提取全部RNA。miRNA文庫的構建和測序由研載生物科技（中國上海）有限公司完成。使用18～30個核苷酸的小RNA用于文庫構建，PCR擴增并測序小RNA。使用blast軟件將獲得的有效讀數與Rfam［19］數據庫（10.0版）比對，E閾值截止值為≤0.01。使用miRDeep 2軟件，用未被注釋的miRNA預測新的miRNA［20］。

DE-miRNAs的篩選及功能分析根據｛log2（fold change）｝≥1.5的標準，使用R語言的DEseq（1.18.0）包，在TAO和正常對照組的的外泌體之間進行篩選，控制FDR＜0.05［21］。利用miRanda數據庫對所鑒定的DE-miRNAs的靶基因進行預測。利用超幾何分布檢驗統計量，進行GO（Gene Ontology）［22］功 能 和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）［23］路徑富集分析。

RT-qPCR定量檢測外泌體miRNA將全部RNA（0.5 μg） 反 轉 錄 為cDNA，使 用PrimeScriptTM RT Master Mix試劑盒［RR036A，寶生物工程（大連）有限公司］檢測miRNA水平或使用PrimeScriptTMII第一鏈cDNA合成試劑盒［6210，寶生物工程（大連）有限公司］檢測mRNA表達。使用Power SYBR Green PCR主混合試劑盒（4367659，美國Thermo Fisher Scientific公司）擴增cDNA產物。RT-qPCR反應條件為：95℃預變性2 min；95℃15 s，循環40次，60℃60 s，循環40次；95℃下15 s、60℃下60 s和95℃下15 s。引物序列如 表1所 示 ，U6用 作 內 參 ，cel-miRR-39-3p標 準RNA（miRB0000010-3-1，廣州銳博生物公司）用作外部參考。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）用作mRNA的管家基因。使用2-△△Ct方法計算miRNA的相對水平和相對mRNA表達。

表1 所有qRT-PCR引物的引物序列Tab 1 The primer sequences of all primers for qRT-PCR

外泌體內化的共聚焦掃描顯微鏡分析使用PKH67染色試劑盒（PKH67GL-1KT，美國Sigma公司）標記PKH67（綠色熒光），觀察HVSMC中的外泌體內化［24］。將從TAO患者血漿中分離的700 μL外泌體添加到1 300 μL稀釋劑C中，再添加16 μL PKH67染料和2 mL稀釋劑C。混合物在室溫下培養5 min，并添加1%牛血清白蛋白（V900933-100G，美國Sigma公司）4 mL以結合過量的染料。混合物在4℃下120 000×g離心90 min，沉淀物（PKH67標記的外泌體）用300 μL PBS重懸。

將密度為1×105/孔的HVSMC接種到24孔培養板中，培養過夜。向細胞中加入10 μg/mL PKH67標記的外泌體，共孵育24 h和48 h后，用4%多聚甲醛固定細胞20 min，加入0.1% Triton X-100，室溫下培養20 min。PBS洗滌后，用DAPI對細胞進行染色，在激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察（TCS SP8，德國Leica公司）。

細胞分組MiR-223-5p模擬物、陰性對照（NC）模擬物和MiR-223-5p抑制劑購自廣州銳博生物技術有限公司。將密度為1×105/孔的HVSMC接種到24孔培養皿中，培養過夜。將細胞分為5組：空白組、NC組、外泌體組、miRNA模擬物組和miRNA抑制劑+外泌體組。使用Lipofectamine 2000，用NC模擬物和miR-223-5p模擬物分別轉染NC組和miRNA模擬物組中的細胞。外泌體組中的細胞用100 μg TAO患者血漿源性外泌體進行處理。對于miRNA抑制劑+外泌體組的細胞，先用Lipofectamine 2000轉 染miR-223-5p抑 制 劑 ，再 用100 μg TAO患者血漿來源外泌體進行處理。空白組細胞不作處理。

細胞活力與凋亡使用CCK-8試劑盒（C0038，上海碧云天生物技術有限公司）檢測HVSMC的細胞活力。細胞培養24、48和72 h，每孔中添加10 μL CCK-8試劑。孵育2 h后，使用微孔板讀取器（MK3，美 國Thermo Fisher Scientific公 司）在450 nm處測量吸光度。

使用Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒（556420，美國Pharmingen公司）檢測HVSMC的細胞凋亡。收集細胞，200×g離心5 min。PBS洗滌，100 μL 1× 結 合 緩 沖 液 重 懸 。 加 入5 μL FITCAnnexin V和5 μL PI（50 mg/mL），25℃黑暗環境中培養15 min。加入400 μL 1×結合緩沖液，通過流式細胞儀（FACScalibur，美國BD公司）獲取圖像，分析細胞凋亡率。所有實驗均重復3次。

雙熒光素酶報告試驗合成hsa-miR-223-5p和VCAM-1 3’非翻譯區（3’-UTR）序列。使用pGL3基本載體［通用生物系統（安徽）有限公司］構建3’-UTR血管內皮細胞黏附分子1（vascular endothelial cell adhesion molecule-1，VCAM-1）報 告 質 粒（pGL3-VCAM1）。 使 用Lipofectamine 2000將pGL3-VCAM1（500 ng）或pGL3基本載體（500 ng）與miR-223-5p模擬物（100 nmol/L）或NC模擬物（100 nmol/L）共轉染至HEK-T293細胞。轉染后48 h，使用雙熒光素酶報告分析系統（E1910，美國Promega公司）測量熒光素酶活性。

統計學分析使用GraphPad Prism 5軟件進行統計分析。兩組數據的比較采用t檢驗。兩組以上的比較采用方差分析（ANOVA）。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

TAO患者和對照組血漿外泌體的鑒定患者和健康對照者的人口學數據無顯著差異（表2）。分別從3名TAO患者和3名健康對照者的血漿樣本中分離出外泌體。透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）結果顯示純化的外泌體顆粒直徑為40～100 nm（圖1A），納米顆粒跟蹤分析（nano-paticle tracking analysis，NTA）顯示從TAO患者和健康對照提取的血漿來源的外泌體具有相似的粒徑分布（圖1B），濃度分別為9.44×1010/mL和1.456×1010/mL。以CD81、CD9和CD63為外泌體標記物，以鈣結合蛋白和白蛋白為NC標記物［25］。Western blot檢測發現，CD81、CD9和CD63在外泌體中均有表達（圖1C）。結果表明，從TAO患者和健康對照者的血漿中成功分離出外泌體。

表2 TAO患者的生理生化指標Tab 2 Physiological and biochemical indexes of TAO patients

為檢測TAO患者血漿來源的外泌體是否能被HVSMC吸收和內化，用PKH67標記外泌體（綠色熒光）。外泌體與HVSMC共培養24 h和48 h后，多數HVSMC顯示綠色熒光，共培養48 h后更多外泌體被HVSMC內化（圖1D）。結果表明，TAO患者血漿來源的外泌體可被HVSMC吸收和內化。

圖1 TAO患者和健康對照血漿源性外泌體的特征Fig 1 Characterization of plasma-derived exosomes from TAO patients and healthy controls

外泌體的MiRNA表達譜和DE-miRNA篩選為確定可能參與TAO發病機制的外泌體miRNA，我們使用miRNA-seq分析來自TAO患者和健康對照的血漿外泌體miRNA譜。結果發現，所有樣本產生的有效讀數在12.08～16.03 moL，注釋的miRNA占總RNA的8.88%～24.69%。共發現523個已知miRNA和309個新預測miRNA。基于｛log2（fold change）｝≥1.0原則，控制FDR＜0.05，比較TAO患者與健康對照者的外泌體miRNA，發現39個DE-miRNA，包 括10個 下 調 和29個 上 調 的miRNA（圖2A）。DE-miRNA表達的熱圖分布如圖2所示。

圖2 篩選TAO患者和健康對照之間的DE-miRNAFig 2 Screening of DE-miRNAs between TAO patients and healthy controls

DE-miRNAs的GO功能和KEGG途 徑富集 分析為解釋TAO中已鑒定的DE-miRNA功能，使用miRanda數據庫預測目標基因，共獲得19 709個預測目標基因，進行GO功能和KEGG途徑富集分析。GO-terms結果表明，已鑒定的DE-miRNA的功能與生物過程中的轉錄調控和信號轉導密切相關，細胞成分包括細胞核、細胞質和細胞液，分子功能有金屬離子結合、ATP結合和DNA結合（圖3A）。我們分析了前20個KEGG通路，發現TAO組和健康對照組的差異有統計學意義（P＜0.05，圖3B）。結果表明，這些DE-miRNA在MAPK信號通路、Rap1信號通路、cAMP信號通路、催產素信號通路和GnRH信號通路中顯著富集。

圖3 GO功能和KEGG富集分析用于已鑒定的DE-miRNAFig 3 GO function and KEGG pathway enrichment analyses for the identified DE-miRNAs

用RT-qPCR驗證外泌體中DE-miRNA，選取前6個DE-miRNAs，包括3個上調miRNA（miR-223-5p、miR-let-7b-3p和miR-127-3p）和3個 下 調miRNA（miR-6529-5p、novel 19_mature和novel 227_mature），通過RT-qPCR進行驗證。與對照組相比，TAO患者血漿源性外泌體中miR-223-5p、miR-let-7b-3p和miR-127-3p水 平 顯 著 升 高（P＜0.001，P＜0.001，P=0.035）；而TAO患者血漿源性外泌體中miR-6529-5p水平顯著降低（P=0.037，圖4）。在TAO患者和健康對照者的血漿源性外泌體中，未發現novel 19_mature和novel 227_mature（P=0.306，P=0.408，圖4）。結果顯示，測序分析結果與RT-qPCR結果的一致性為66.67%，表明測序結果具有較高的可靠性。由于miR-223-5p較miR-let-7b-3p和miR-127-3p升高更明顯，在接下來的實驗中將予以重點關注。

圖4 RT-qPCR檢測TAO患者和健康對照者血漿分離的外泌體中DE-miRNA表達水平Fig 4 Expression level of DE-miRNAs in the exosomes isolated from the plasma of TAO patients and healthy controls by RT-PCR

TAO患者血漿源性外泌體通過上調miR-223-5p抑制HVSMC的細胞活力和促進細胞凋亡。為證明TAO血漿來源的外泌體和miR-223-5p是否影響HVSMC的細胞活力和凋亡，使用miR-223-5p模擬物過表達miR-223-5p，使用miR-223-5p抑制劑阻斷miR-223-5p表達。空白組和NC組之間的miR-223-5p水平差異無統計學意義（P=0.240，圖5A）。細胞與TAO患者血漿源性外泌體和miR-223-5p模擬物共同孵育后，miR-223-5p水平顯著升高（P＜0.001），與NC組相比，miRNA模擬物組的miR-223-5p水平升高100倍以上（圖5A）。miR-223-5p抑制劑與TAO患者血漿源性外泌體結合后，外泌體誘導的miR-223-5p恢復至空白組水平（圖5）。檢測VCAM-1和胰島素樣生長因子1受體（insulin-like growth factor-1 receptor，IGF-1R）的表達。發現空白組和NC組之間的VCAM-1和IGF-1R表達差異無統計學意義（P=0.248，P=0.418，圖5B、5C）。與空白組相比，外泌體組和miR-223-5p模擬組的VCAM-1（P=0.005，P=0.005）和IGF-1R（P=0.004，P=0.003）表達明顯下調（圖5B、5C）；miRNA抑制劑+外泌體組的VCAM-1表達明顯高于外泌體組（P=0.011）和miR-223-5p模 擬 物 組（P=0.004，圖5B）；miRNA抑制劑+外泌體組的IGF-1R表達明顯高于外泌體組（P=0.010）和miR-223-5p模擬物組（P=0.006，圖5C）。

圖5 miR-223-5p和外泌體對不同處理的HVSMC的影響Fig 5 Effects of miR-223-5p and exosomes on HVSMC with different treatments

我們評估了不同處理對HVSMC細胞活力和凋亡的影響。與NC組相比，TAO血漿分離外泌體和miR-223-5p模 擬 物 轉 染 后24、48和72 h，HVSMC的細胞活力均被顯著抑制（P均＜0.001，圖6A）。在3個時間點，與單獨使用外泌體處理相比，聯合使用外泌體和miR-223-5p抑制劑顯著恢復了細胞活力（P＜0.001，P＜0.001，P=0.011，圖6A），表明TAO患者血漿外泌體對HVSMC細胞活力的抑制作用是通過miR-223-5p的過表達介導的。流式細胞檢測結果顯示，與空白組相比，外泌體組和miR-223-5p模擬物組細胞凋亡顯著增加（P=0.001，P=0.001，圖6B）。miR-223-5p抑制劑下調miR-223-5p，可顯著改善TAO患者血漿外泌體誘導的細胞凋亡（P＜0.001，圖6B）。結果表明，TAO患者血漿外泌體誘導的細胞凋亡通過上調HVSMC的miR-223-5p介導。

圖6 miR-223-5p和外泌體對不同處理的HVSMC細胞活力和凋亡的影響Fig 6 Effects of miR-223-5p and exosomes on cell viability and apoptosis of HVSMCs with different treatments

VCAM-1直接與miR-223-5p結合TargetScan Human 7.1預 測VCAM-1是miR-223-5p的下游基因（圖7A），因為VCAM-1的3’-UTR包含miR-223-5p的結合位點。采用雙熒光素酶報告試驗發現，轉染NC模擬物的pGL3基本載體、轉染miR-223-5p模擬物的pGL基本載體和轉染NC模擬物的pGLVCAM-1之間的相對熒光素酶活性差異無統計學意義（P=0.659，圖7）。在pGL-VCAM-1中，與轉染NC模擬物相比，轉染miR-223-5p后的相對熒光素酶活性顯著降低（P=0.006，圖7）。結果表明，VCAM-1是miR-223-5p的 下 游 靶 點。

圖7 熒光素酶報告分析法測定miR-223-5p和VCAM-1之間的相互作用Fig 7 Interaction between miR-223-5p and VCAM-1 determined by luciferase reporter assay

討 論

外泌體miRNA在許多疾病的發生發展中起關鍵作用，被認為是可用于臨床的潛在非侵入性生物標記物［26-27］，現已證明循環外泌體miRNA對幾種人類癌癥的臨床意義［28-29］。本研究關注TAO患者循環外泌體miRNA譜。我們從TAO患者和健康對照血漿中提取純化外泌體，比較外泌體miRNA表達譜，發現39個DE-miRNA，在一定范圍內富集并調控轉錄相關的一系列生物學過程和調控各種信號通路，如cAMP信號通路和MAPK通路，這與已知研究一致，表明這兩種途徑在炎癥性疾病中發揮作用，并可能作為治療靶點［30-31］。RT-qPCR進一步驗證測序分析，表明測序結果具有較高的可靠性。

外泌體作為蛋白質和核酸的載體，可以將生物活性物質從供體細胞傳遞到受體細胞，從而影響受體細胞的生物功能［32］。我們觀察到TAO患者血漿外泌體可被HVSMC吸收和內化，用其處理HVSMC可抑制其細胞活力并誘導凋亡。與空白組相比，TAO患者血漿外泌體可顯著增加miR-223-5P水 平 和 下 調VCAM-1和IGF-1R。Ham等［33］指出，乳腺癌來源的外泌體可部分通過gp130/STAT3信號傳導誘導巨噬細胞分泌IL-6和促生存表型。另一項研究發現，缺氧可促進胃癌細胞增殖、侵襲、遷移和上皮-間充質轉化，從而促進胃癌進展和轉移。結合本研究結果，推斷TAO患者血漿來源的外泌體通過調節HVSMC的存活和凋亡，促進TAO發生和發展。

由于miR-223-5p上調作用明顯，我們進一步探索外源性miR-223-5p對HVSMC的影響，發現miR-223-5p過表達顯著抑制細胞活力并誘導細胞凋亡，而miR-223-5p下調可抑制TAO患者血漿外泌體誘導HVSMC細胞凋亡和細胞活力降低的作用。這表明miR-223-5p介導了TAO患者血漿外泌體對HVSMC的促凋亡作用。miR-223是一種抗炎性miRNA，主要存在于髓樣細胞中，并參與轉錄后調節一組對炎癥、細胞增殖和侵襲至關重要的基因［34］。血管平滑肌細胞中富含miR-223，其在血管平滑肌細胞增殖、遷移和血管重塑中的作用已明確［35-36］。miR-223也 是 外 泌 體 中 一 個 重 要 的miRNA，通過外泌體的細胞間轉移參與受體細胞的生物功能調節［37-38］。在小鼠模型中miR-223-5p與膿毒癥誘導的炎癥和心肌功能障礙有關［39］。循環外泌體中的miR-223-5p可能是高血壓的診斷生物標志物［40］。越來越多的證據表明，循環外泌體中的miR-223-5p或miR-223水平與香煙煙霧有關，香煙煙霧是導致TAO的關鍵因素［41］。本研究表明，TAO循環外泌體的miR-223-5p抑制HVSMC細胞活力并誘導細胞凋亡。因此，循環外泌體miR-223-5p可能在TAO的發生發展中起調節作用。

VCAM-1是參與炎癥相關血管黏附的重要血管內皮炎癥標記物，可能是一種血管功能障礙的生物標記物［42］。TAO患者增厚的血管內皮細胞和一些炎癥細胞中VCAM-1表達增加［43］。人臍靜脈內皮細胞中血小板衍生微粒刺激引起VCAM-1上調［44］。IGF-1R是胰島素受體家族的一員，參與心臟和神經系統的多種生理功能［45］。斑塊組織中IGF-1R表達降低與臨床心血管事件有關［46］。血小板分泌的miR-223通過靶向IGF-1R促進內皮細胞凋亡［47］。Wang等［48］研究發現，血小板來源miR-223對動脈血栓形成的調節功能通過血管壁IGF-1R介導。暴露于TAO患者血漿外泌體后，HVSMC中VCAM-1和IGF-1R的表達顯著下調，通過miR-223-5p抑制劑可使下調恢復。這些結果均表明，VCAM-1是miR-223的下游靶點。雙熒光素酶報告分析證實VCAM-1直接與miR-223-5p結合。我們發現，TAO患者血漿外泌體通過miR223-5p/VCAM-1途徑對HVSMC產生促凋亡活性，并介導IGF-1R表達。通過IL-6/信號轉導和轉錄激活因子（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）途徑，調節VCAM-1和細胞間黏附分子（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）的 表達［49］。miR-223通 過靶向STAT3促進巨噬細 胞 產生IL-6［50］。我們推測，血漿外泌體miR-223-5p可能通過IL-6/STAT3途徑，促進TAO發生發展。

本研究有一定的局限性：首先，樣本量小，大樣本量研究對于驗證我們的發現至關重要。第二，通過超速離心分離外泌體，由于小而易碎的顆粒或沉淀效率，收集的外泌體數量并不一致，今后可應用分離純度更高的新方法［32］。第三，從TAO患者和健康對照中分離出外泌體，由于外泌體的體內來源復雜，雖然HVSMC的細胞活力和凋亡受外泌體或miR-223-5p的影響，但尚未發現其分子機制和其他因素。

綜上所述，TAO患者血漿來源的外泌體可抑制HVSMC的細胞活力并誘導細胞凋亡，其機制涉及靶向VCAM-1的外體miR-223-5p的上調。外泌體miR-223-5p可能在TAO的發病機制中發揮作用，為miR-223-5p/VCAM-1作為TAO治療的新靶點和途徑提供了參考。

作者貢獻聲明陳波 數據采集，統計分析，論文撰寫和修訂。林學廣 數據采集，統計分析。鄧穎 數據分析和解釋。王博 數據采集。童進東，余波 論文構思。史衛軍 論文修訂。湯敬東 論文構思和修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。