乳腺癌患者循環(huán)外泌體miR-9與E-cadherin表達及腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系*

符傳超，陸裕富，文欽夫

（文昌市人民醫(yī)院心胸甲乳外科，文昌 571300）

乳腺癌前哨淋巴結(jié)活檢術(shù)（SLNB）在上世紀90年代首次被報道為腋窩淋巴結(jié)分期技術(shù)，并逐漸成為評估腋窩淋巴結(jié)（ALN）狀態(tài)的金標準[1]。SLNB存在淋巴水腫、肩關(guān)節(jié)活動度受損等問題，甚至輻射暴露風(fēng)險。有研究證實，在平均8年的隨訪期內(nèi)，前哨淋巴結(jié)陰性患者的區(qū)域淋巴結(jié)復(fù)發(fā)率極低（0.4%）[2]。因此，臨床上急需尋找一種侵入性更小的方法來評估術(shù)前ALN 狀態(tài)，并安全地避免在無ALN 轉(zhuǎn)移的患者中使用SLNB，這將有助于改善患者的身體狀況，同時保持高無復(fù)發(fā)率和總體生存率。

miRNA 是一種小的非編碼RNA，通過與特定基因的30 個未翻譯區(qū)域結(jié)合來調(diào)節(jié)基因表達[3]，并在循環(huán)外泌體中穩(wěn)定存在[4]。血清外泌體miRNA是檢測乳腺癌的潛在生物標志物[5-7]。有研究表明，miR-9 在乳腺癌細胞中的表達上調(diào)，其靶向編碼E-鈣黏連蛋白（E-cadherin）的信使RNA，導(dǎo)致細胞運動性和侵襲性增加[8-9]。然而缺乏相關(guān)的臨床證據(jù)證實血清外泌體miR-9 在預(yù)測乳腺癌患者ALN 狀態(tài)中的價值。本研究回顧性分析了169例乳腺癌患者的臨床資料，旨在分析血清外泌體miR-9 與組織E-cadherin表達及ALN轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 回顧性分析2018 年1 月至2021 年12月在本院乳腺外科和腫瘤科接受手術(shù)的169例原發(fā)性乳腺癌患者的臨床資料，年齡28～103歲，平均（51.95±10.71）歲。病例納入標準：（1）女性單側(cè)原發(fā)性乳腺浸潤性導(dǎo)管癌（IDC）[10]，診斷時無遠處轉(zhuǎn)移；（2）行乳腺切除術(shù)或保乳手術(shù)，以及ALN 清掃（ALND）；（3）術(shù)前無新輔助治療；（4）病理檢查確定腫瘤已完全切除，且無其他器官惡性腫瘤。排除標準：（1）男性乳腺癌；（2）繼發(fā)性乳腺癌；（3）雙側(cè)乳腺癌（同步或異時）；（4）未行ALND 的前哨淋巴結(jié)（SLN）轉(zhuǎn)移患者，未行SLNB的患者，以及腫瘤亞型尚不明確的患者。每3個月電話隨訪1次。另選取同期在本院行體格檢查的健康志愿者150例作為對照組，年齡31～85歲，平均（55.03±10.40）歲，對照組與乳腺癌患者年齡、性別比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 循環(huán)血清外泌體的提取與鑒定 術(shù)前采集乳腺癌患者的靜脈血，1 500 r/min 離心10 min，再以20 000 r/min離心10 min，收集上清液，保存在-80 ℃冰箱中。按照總外泌體分離試劑盒（美國Invitrogen公司）說明書操作，將60 μL 外泌體分離試劑加入300μL 血清樣本中，渦流混合，4 ℃下靜置30 min，室溫下12 000 r/min 離心10 min，棄去上清液，重懸于100μL磷酸鹽緩沖液中。外泌體樣品用1%戊二醛固定，并放入碳涂層銅網(wǎng)格中，將草酸鈾酰溶液（pH 7.0）覆蓋在網(wǎng)格上5 min。使用Tecnai G2 透射電鏡觀察外泌體形態(tài)，ZetaView納米顆粒追蹤儀確定外泌體的大小。通過Western blotting法檢測CD9和CD81 外泌體標記膜蛋白。CD9 和CD81 抗體均購自英國Abcam公司。

1.3 RT-qPCR 法檢測血清外泌體miR-9 表達 使用miRcute miRNA 分離試劑盒（中國北京天根）從外泌體中提取miRNA。使用miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒（日本TaKaRa）對提取的miRNA進行反轉(zhuǎn)錄。使用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ試劑（日本TaKaRa）進行PCR擴增。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火、延伸32 s，共40個循環(huán)。以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計算miR-9相對表達量。

1.4 免疫組化法檢測乳腺癌組織中E-cadherin 表達 乳腺癌組織以10%甲醛溶液固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，制備4 μm厚連續(xù)切片，按照E-cadherin免疫組化試劑盒說明書檢測乳腺癌組織中E-cadherin蛋白表達。E-cadherin單克隆抗體購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。顯微鏡下隨機選取5個視野，E-cadherin以細胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，計算陽性細胞所占百分比，陽性細胞百分比≥10%為陽性，＜10%為陰性[11]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）[M（P25～P75）]表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗；計數(shù)資料以百分率表示，率的比較采用χ2檢驗；采用多因素Logistic回歸分析方法分析影響乳腺癌患者ALN轉(zhuǎn)移的獨立危險因素，受試者工作特征（ROC）曲線分析循環(huán)外泌體miR-9表達預(yù)測乳腺癌患者ALN 轉(zhuǎn)移的臨床價值，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 循環(huán)血清外泌體獲取及鑒定 透射電鏡下可見囊泡呈圓形，直徑30～150 nm（圖1A）。納米顆粒追蹤顯示囊泡的平均直徑為100 nm，濃度約為2.5×107個/mL（圖1B）。Western blotting 顯示，CD9和CD81表達于分離的囊泡上（圖1C）。結(jié)果表明從血清中分離的囊泡為外泌體。

圖1 循環(huán)血清樣本中分離的外泌體鑒定

2.2 乳腺癌患者血清外泌體miR-9 表達 乳腺癌患者血清外泌體miR-9 表達水平為1.21（1.04～1.94），高于對照組的0.97（0.79～1.16）（Z=-7.226，P＜0.001）。

2.3 乳腺癌組織與癌旁組織中E-cadherin 表達比較 乳腺癌組織中E-cadherin 陽性表達率為37.87%，顯著低于癌旁組織的67.46%（χ2=29.671，P＜0.05，n=64），見圖2。

圖2 組織中E-cadherin表達情況（×200）

2.4 乳腺癌患者血清外泌體miR-9 表達與E-cadherin表達的關(guān)系 E-cadherin表達陽性患者血清外泌體miR-9 表達水平為1.04（0.94～1.57），低于Ecadherin表達陰性患者的1.35（1.17～2.24）（Z=-5.993，P＜0.001）。

2.5 乳腺癌患者血清外泌體miR-9 水平與臨床病理特征的關(guān)系 根據(jù)血清外泌體miR-9 表達中位值，將乳腺癌患者分為miR-9 低表達組（≤1.21）和miR-9 高表達組（＞1.21）。乳腺癌患者血清外泌體miR-9 表達水平與年齡、分子亞型、組織學(xué)分級、有無血管侵犯、有無神經(jīng)浸潤無關(guān)（P＞0.05），與腫瘤最大直徑、AJCC 臨床分期、TNM 分期、有無淋巴管侵犯、E-cadherin 表達、ALN 轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05），見表1。

表1 乳腺癌患者血清外泌體miR-9表達與臨床病理特征的關(guān)系n（%）

2.6 乳腺癌患者ALN 轉(zhuǎn)移的影響因素分析 無ALN轉(zhuǎn)移組與有ALN轉(zhuǎn)移組患者年齡、分子亞型、組織學(xué)分級、神經(jīng)浸潤比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），兩組腫瘤最大直徑、AJCC 臨床分期、血管侵犯、淋巴管侵犯、E-cadherin表達及外泌體miR-9 表達比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。將上述差異有統(tǒng)計學(xué)意義的變量進一步納入多因素Logistic 回歸分析中，結(jié)果顯示：AJCC 臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴管侵犯、血清外泌體miR-9表達水平升高均為乳腺癌患者ALN轉(zhuǎn)移的危險因素（均P＜0.05），見表3。

表2 影響乳腺癌患者ALN轉(zhuǎn)移的單因素分析結(jié)果n（%）

表3 影響乳腺癌患者ALN轉(zhuǎn)移的多因素Logistic回歸分析結(jié)果

2.7 血清外泌體miR-9水平與ALN轉(zhuǎn)移的關(guān)系 ALN 轉(zhuǎn)移患者血清外泌體miR-9 表達水平為1.54（1.00～2.00），顯著高于無ALN轉(zhuǎn)移患者的0.91（0.78～0.98）（Z=-8.011，P＜0.001）。血清外泌體miR-9 表達預(yù)測乳腺癌患者ALN 轉(zhuǎn)移的AUC 為0.859（95%CI：0.805～0.913），對應(yīng)截斷值為1.00，特異度為81.3%，靈敏度為75.5%，見圖3。

圖3 血清外泌體miR-9 表達對乳腺癌患者ALN 轉(zhuǎn)移的預(yù)測價值

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，ALN 轉(zhuǎn)移患者血清外泌體miR-9表達水平顯著高于無ALN轉(zhuǎn)移患者，提示術(shù)前血清外泌體miR-9水平升高與ALN轉(zhuǎn)移有關(guān)。此外，乳腺癌組織E-cadherin 表達與外泌體miR-9 表達呈負相關(guān)關(guān)系，提示循環(huán)外泌體miR-9 可能通過miR-9/E-cadherin軸依賴性機制影響B(tài)C淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

miR-9可通過直接結(jié)合靶基因在轉(zhuǎn)錄后抑制基因表達促進乳腺癌發(fā)生、發(fā)展[8]。miR-9的表達可被致癌轉(zhuǎn)錄因子MYC 激活，通過直接靶向關(guān)鍵的轉(zhuǎn)移抑制蛋白E-cadherin 來提高細胞運動性和侵襲性[9,12]。E-cadherin 低表達激活β-catenin 信號，促進血管內(nèi)皮生長因子表達，導(dǎo)致腫瘤血管生成，并使腫瘤細胞對腫瘤微環(huán)境產(chǎn)生的上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）誘導(dǎo)信號敏感，導(dǎo)致腫瘤細胞更容易擴散和轉(zhuǎn)移[13]。研究顯示，miR-9 能通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)STARD13 表達促進乳腺癌EMT 和轉(zhuǎn)移[14]。除了通過抑制靶向基因促進乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移外，miR-9 還可以介導(dǎo)競爭性內(nèi)源RNA 來參與癌細胞轉(zhuǎn)移[8]。miR-9 可與腫瘤抑制基因叉頭框蛋白O1（FOXO1）和E-cadherin-3’非翻譯區(qū)結(jié)合，F(xiàn)OXO1 和E-cadherin-3’非翻譯區(qū)之間存在miR-9 的競爭，因此FOXO1 3’非翻譯區(qū)通過miR-9 介導(dǎo)的競爭性內(nèi)源RNA機制誘導(dǎo)E-cadherin表達來抑制乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移[9]。致癌基因CYP4Z1 3'非翻譯區(qū)也可通過與Ecadherin 競爭性結(jié)合miR-9 而抑制乳腺癌細胞的遷移和EMT[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-9 的下游效應(yīng)子白血病抑制因子受體通過觸發(fā)Hippo通路導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄共激活因子YES相關(guān)蛋白的磷酸化、細胞質(zhì)滯留和功能失活，進而抑制乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移[16]。以上研究提示miR-9 可以通過不同的機制誘導(dǎo)乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移，其可能為浸潤性乳腺癌的潛在治療靶點。

研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤來源的外泌體攜帶反映起源癌細胞遺傳或信號改變的物質(zhì)，通過將miRNA和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到正常組織參與腫瘤轉(zhuǎn)移過程[7]。Kia 等[17]發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細胞株MDA-MB-231通過外泌體傳遞miR-9增強低侵襲轉(zhuǎn)移性細胞株MCF-7侵襲和遷移能力。在乳腺癌遠處轉(zhuǎn)移灶中發(fā)現(xiàn)miR-9表達水平顯著高于相應(yīng)的原發(fā)性腫瘤[18]。miR-9通過調(diào)控Ecadherin表達影響細胞侵襲性，miR-9過表達與乳腺癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[19]。這些結(jié)果表明miR-9為調(diào)控乳腺癌轉(zhuǎn)移的重要因子。本研究中，ALN轉(zhuǎn)移患者的血清外泌體miR-9水平高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，提示miR-9 參與了乳腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；Ecadherin 表達陽性患者血清外泌體miR-9 表達水平顯著低于E-cadherin表達陰性患者，較高的miR-9表達與E-cadherin低表達之間存在顯著關(guān)聯(lián)。因此推測循環(huán)外泌體通過miR-9/E-cadherin 軸依賴性機制影響乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

綜上，乳腺癌患者血清外泌體miR-9 高表達可能在ALN轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，且miR-9高表達可能通過調(diào)節(jié)E-cadherin 來實現(xiàn)乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移，因此檢測血清外泌體miR-9 可能有助于術(shù)前診斷ALN轉(zhuǎn)移。