腦膠質瘤病人血漿miR-9-3p的變化及其與病人臨床預后的關系

孫玉書 王 飛 王振飛 王選平 牟永平

膠質瘤是成人顱內最常見的惡性腫瘤[1]。近年來，膠質瘤的治療主要依靠手術切除，并結合放療和化療的聯合治療，但腦膠質瘤具有高度侵襲性，術后容易復發，中位生存期僅12個月[2]。因此，探討腦膠質瘤的發病機制，尋找新的診斷和治療方法顯得尤為重要。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一類長度22～24 個核苷的非編碼RNA，在進化上高度保守，通過與靶基因mRNA 3'-UTR區域結合調控基因的表達，調節細胞分化、凋亡、細胞周期、增殖和分裂等[3，4]。Yang 等[5]研究發現，腦膠質瘤組織miRNA 芯片差異表達譜中miR-9-3p 表達下調。本文選取42例腦膠質瘤和20 例健康體檢者為對照，用RT-PCR法檢測血漿miR-9-3p 水平，分析血漿miR-9-3p 水平與腦膠質瘤病人生存預后的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2016 年3 月1 日至2019 年3 月1日收治的腦膠質瘤42 例，其中男23 例，女19 例；年齡14～68 歲。另選20 例同期健康查體者為對照，其中男11例，女9例；年齡18～65歲。本研究經內蒙古醫科大學倫理委員會批準，病人簽署知情同意書。

1.2 術后隨訪 采用電話、微信、門診等方式隨訪，隨訪時間為手術之日到死亡或末次隨訪時間至2021年3月1日。本文42例腦膠質瘤隨訪24～60個月，記錄生存情況。

1.3 PCR 檢測血漿miR-9-3p 水平 術前取靜脈血2 ml，離心分離血漿備用。使用miRcute miRNA 血清/血漿提取分離試劑盒（北京天根生化公司）提取血漿總RNA，測定總RNA 濃度和純度，置-80 ℃保存備用。使用增強型miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒（北京天根生化公司）反轉錄為cDNA，應用miRcute（SYBR Green）增強型miRNA 熒光定量檢測試劑盒（北京天根生化公司）擴增，使用ABI 公司7500 系列實時熒光定量PCR 儀進行擴增。擴增條件：95 ℃、15 min 起始模板變性，然后94 ℃、20 s，64 ℃、30 s，5個循環，富集低豐度目標miRNA，94 ℃、20 s，PCR循環中模板變性；72 ℃、34 s 退火、延伸；60 ℃、34 s 收集熒光，40 個循環。檢測重復3 次，取平均值。以U6為內參，應用2-ΔCT法量化分析。以血漿miR-9-3p平均值為準，分為低表達和高表達。miR-9-3p 引物正義鏈5'-TCT TTG GTT ATC TAG CTG TAT GA-3'，反義鏈5'-ATA CAG CTA GAT AAC CAA AGA TT-3'。

1.4 統計學方法 采用SPSS 25.0軟件分析；定量資料以±s表示，采用t檢驗；計數資料采用χ2檢驗；多因素Cox 比例回歸風險模型分析生存預后影響因素；Kaplan-Meier 生存曲線分析miR-9-3p 水平與腦膠質瘤生存預后的關系；檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 腦膠質瘤病人血漿miR-9-3p的變化 與對照組相比，腦膠質瘤病人血漿miR-9-3p 水平明顯下降（P＜0.05，圖1）。

圖1 腦膠質瘤病人血漿miR-9-3p水平明顯降低

2.2 血漿miR-9-3p 水平與腦膠質瘤病人臨床特征的關系 腦膠質瘤病人血漿miR-9-3p 與病人年齡、性別、腫瘤位置無明顯相關性（P＞0.05），而與腦膠質瘤病理分級相關（P＜0.05）。見表1。

表1 血漿miR-9-3p水平與腦膠質瘤病人臨床特征的關系

2.3 腦膠質瘤病人預后影響因素 多因素Cox回歸分析顯示，腫瘤病理分級Ⅰ～Ⅱ級（OR=0.026；95% CI 0.002～0.366；P=0.007）、血漿miR-9-3p 高表達（OR=0.047；95% CI 0.004～0.502；P=0.011）的腦膠質瘤病人生存預后較好。

2.4 血漿miR-9-3p 水平與腦膠質瘤病人生存期的關系 生存曲線分析顯示，血漿miR-9-3p 低表達腦膠質瘤病人中位總生存期較高表達腦膠質瘤病人明顯縮短（P＜0.05，圖2）。

圖2 生存曲線分析血漿miR-9-3p水平與腦膠質瘤病人生存期的關系

3 討論

miRNA 既可作為抑癌基因下調癌基因活性，也可作為癌基因下調抑癌基因活性，參與人類腫瘤的形成[6]。miR-9-3p定位于15號染色體q26.1，在多種腫瘤中異常表達。研究表明，甲狀腺髓樣癌miR-9-3p 表達上調，靶向調控BLCAP 抑制細胞凋亡，促進腫瘤生長[7]。但也有研究表明miR-9-3p具有抑制腫瘤生長的作用，例如乳腺癌miR-9-3p 靶向調節ITGB1的表達，抑制乳腺癌生長[8]，肝癌細胞miR-9-3p靶向調控TAZ 發揮抑癌基因的作用[9]。本文結果顯示腦膠質瘤病人血漿miR-9-3p顯著下調，與膠質瘤病理分級密切相關，是病人生存預后不良的獨立危險因素。杜鵬等[10]研究發現miR-9 通過促進LDHA表達，增強腫瘤細胞有氧糖酵解，促進人腦膠質瘤LN229 細胞增殖。這提示miR-9-3p 在人腦膠質瘤中具有抑癌基因的功能。

總之，人腦膠質瘤miR-9-3p 表達下調，與病人不良生存預后密切相關。