腦海綿狀血管畸形KLF2、KLF4信號通路的研究進展

張 峰綜述 劉 利審校

腦海綿狀血管畸形（cerebral cavernous malformations，CCM）是由桑椹樣擴大的不規則血管形成的，缺乏平滑肌、彈性組織和完整的基底膜，因此血管壁薄，易滲漏[1]。CCM的發病率約為0.5%，以中樞神經系統多見，導致頭疼、中風、癲癇發作和局灶性神經功能缺失。CCM 發病形式包括散發性CCM（sporadic CCM，SCCM）和家族性CCM（familial CCM，FCCM），其中FCCM 與染色體7q 的CCM1（KRIT1）、染色體7p 的CCM2（OSM）和染色體3q 的CCM3（PDCD10）基因有關。研究發現，參與CCM 損傷的信號通路有：MEKK3-Krüppel樣因子（Krüppellike factor，KLF）2/4、RhoA/ROCK、內皮-間充質轉化（endothelial-to-mesenchymal transition，EndMT）、血小板反應蛋白1（thrombospondin 1，TSP1）丟失、促炎狀態、氧化應激和自噬[2，3]。本文主要介紹KLF2、KLF4在CCM信號通路中所起的作用。

1 KLF2、KLF4結構和功能

KLF家族是真核生物體內一類結構高度保守的轉錄因子，其C-末端有3個連續高度保守的C2H2鋅指結構域，通過結合靶基因啟動子GC 富含序列，調控相應基因的表達；其N-末端屬于轉錄調控結構域，高度變異，通過結合特異蛋白質，介導多種因子的轉錄。KLF4在人體內表達廣泛，主要存在于細胞核內，其特征是：因作用靶基因的不同，具有轉錄活化或轉錄抑制的雙重調節作用。KLF4 通過對其下游靶基因的調控，參與細胞的增殖、分化、凋亡以及血管生成和腫瘤的發生發展[4]。KLF2可受血流切應力的誘導，調節內皮細胞多種功能基因的表達，參與調節炎癥、凝血、血管舒縮和血管生成等多種過程[5]。KLF2和KLF4之間有許多共同的靶點，但它們對共同調控的啟動子在親和力方面存在個體差異，因而表現出特異性。Zhou 等[6]發現，CCM 小鼠模型的早期形成與KLF2、KLF4的過度表達和Rho/ROCK活性的增加有關。當CCM 蛋白缺陷后，激活MEKK3-MEK5-ERK5-MEF2 信號軸，使轉錄因子KLF2、KLF4 表達增加[7]，KLF2 可進一步激活下游RhoA/ROCK信號通路，而KLF4則激活其下游的EndMT信號通路[8]，KLF2 與KLF4 二者也可共同作用于TSP1，使其表達減少，從而促進CCM的發展及其出血性演變[9]。目前認為，KLF2、KLF4 是CCM 早期發展和進展的關鍵，可以作為CCM發病機制的研究重點。

2 信號轉導

2.1 KLF2/4 與MEKK3-MEK5-ERK5-MEF2 信 號 軸有絲分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路表達于所有真核生物內，是將細胞上接收的刺激信號傳遞到相應蛋白所必需的信號通路。因此，MAPK通路在細胞的炎癥反應、分化、生長和增殖等過程中起著非常重要的作用。MAPK 激酶激酶3（MAPK kinase kinase 3，MEKK3）是MAPK 信號通路中重要的節點，通過磷酸化激活細胞外信號調節激酶激酶5（Mitogen/extracellular signal-regulated kinase kinase 5，MEK5），進一步激活細胞外信號調節蛋白激酶5（extracellular signal-regulated protein kinase 5，ERK5）從而發揮生物學效應。Maddaluno 等[7]發現，人體內三種CCM蛋白相互作用形成的蛋白質復合物（CCM signaling complex，CSC）是MEKK3 級聯反應的抑制因子。當CSC 蛋白缺陷后，會激活MEKK3，激活MEKK3-MEK5-ERK5信號途徑。磷酸化ERK5可以通過調節肌細胞增強因子2A、2C的轉錄活性，進一步促進KLF2、KLF4的表達[8，9]。Cuttano等[10]發現，敲除KLF4基因表達可顯著降低CCM1小鼠病死率，并適度改善血管病變。

2.2 TLR4、CDC42 與MEKK3-KLF2/4 Toll 樣受體4（toll like receptors 4，TLR4）可識別病原微生物細胞壁上的保守成分脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）。LPS作為Ⅰ型急性期反應蛋白可誘導機體產生炎癥免疫反應。TLR4也是一種保守的Ⅰ型跨膜蛋白，可以將細胞外刺激傳遞到細胞內，進而通過信號轉導參與多種疾病發生發展過程。Tang 等[11]在CCM1 小鼠模型中發現，誘導革蘭氏陰性細菌膿腫，會顯著增加CCM病變表型的嚴重程度，提示TLR4可能是MEKK3 的上游靶點。當革蘭氏陰性細菌產生LPS 后，可被TLR4 蛋白識別，進一步通過TLR4-MEKK3-KLF2/4信號途徑來加速CCM的形成。

細胞分裂周期蛋白42（cell division cycle 42，CDC42）是Ras 超家族GTP 酶中的核心成員，位于細胞質，包含191個氨基酸，主要參與調解細胞骨架中肌動蛋白重排與調控蛋白激酶，并通過在與GTP 結合/活化狀態和與GDP 結合/失活狀態之間循環切換，從而在復雜的細胞信號轉導網絡中起到開關作用。當CDC42 功能喪失后，會損害腦內皮細胞的發芽、分支形態發生、軸向極性以及其在腦組織中的正常分布。Castro等[12]發現，CDC42也參與CSC之間的相互作用并形成復合物，當腦內皮細胞CDC42 缺失后，也通過激活MEKK3-MEK5-ERK5 信號通路，進而導致KLF2、KLF4的過表達，誘導CCM的形成。

2.3 KLF2 與RhoA/ROCK 信 號 通 路RhoA 是 一 種 小的GTP 結合蛋白，具有高度保守的GDP/GTP 結合區、GTP酶活性區、靶區和膜定位結構。作為一種分子開關，RhoA 的主要功能是調節細胞骨架重組、細胞生長和基因表達，在細胞信號轉導通路中起著重要的作用。RhoA 的功能主要是通過ROCK實現的，ROCK有ROCK1和ROCK2兩種異構體，在激酶結構域的水平上有65%的總體同源性和92%的相似性。Richardson等[13]發現，當體內出現任何一種CCM蛋白缺陷，都會激活MEKK3-KLF2-RhoA-ROCK1/2-pMLC 信號通路，最終導致肌動蛋白應激纖維的增加、細胞黏附性的降低以及血管通透性增加；當抑制KLF2 表達時，CCM1 小鼠模型中病變表現出99%的恢復，且組織學上只有少量的小靜脈擴張。

2.4 KLF4 與EndMT EndMT 被認為是上皮間質轉分化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）的一種亞型，是指內皮細胞失去其自身特性而獲得間質細胞和干細胞樣特性的表型轉變過程。EndMT的特點是細胞連接結構的改變、細胞極性喪失，細胞增殖或遷移增加，最終導致血管生成增加，并可在炎性微環境下形成桑椹狀[14]。在正常人體內，CSC可通過抑制小GTP酶RAS相關蛋白1的效應器來控制內皮細胞屏障功能。在CCM蛋白缺陷的情況下，腦內皮細胞間粘附連接減少，可誘發內皮細胞經歷EndMT 形成CCM。EndMT 主要是由內源性骨形態發生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）6 上調介導的，可激活EndMT 發生有關的BMP 和轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）信號通路[7]。Zhang 等[15]發現，KLF4 是CCM 蛋白缺陷后產生End-MT 的關鍵。BMP6 作為KLF4 的靶基因，KLF4 可以通過誘導BMP6 啟動子的活性，從而誘發EndMT 的形成。研究報道，KLF4除誘導BMP6外，還可以直接通過與某些EndMT 標志物啟動子的結合來誘導EndMT 的產生，如干細胞抗原1（stem cell antigen 1，SCA1）和成纖維細胞特異性蛋白（fibroblast-specific protein 1，FSP1）。同時，在CCM1 小鼠模型中，KLF4基因敲除既會顯著降低EndMT典型標志物（DNA結合抑制因子1、FPS1、SCA1）中mRNA與蛋白水平，又會導致與EndMT發生有關的BMP6被強烈抑制。

2.5 KLF2/4 與TSP1 TSP1 是一種細胞基質糖蛋白，可通過調節細胞增殖、黏附和凋亡，來維持細胞平衡；同時，TSP1 也是最有效和最具特征性的內源性血管生成抑制劑之一，在血管生成過程中表達上調，通過抑制體內基質金屬蛋白酶的表達來抑制血管生成，從而限制血管密度。Lopez-Ramirez 等[8]發現，CCM 蛋白缺失后會引起KLF2 和KLF4 的過表達，從而導致其下游TSP1 的表達被抑制。TSP1 可以促進血管內皮細胞生長因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）降解，從而抑制VEGFR2 信號通路。當TSP1 表達減少時，會增強VEGFR2 信號通路，從而導致CCM 的發生。VEGFR2 也與內皮細胞有絲分裂和血管生成密切相關。當VEGFR2活化后，可增加參與內皮細胞滲漏、應力纖維形成和血管生成密切相關的血管內皮鈣粘蛋白和Beta連環蛋白磷酸化和遷移，從而誘發CCM病變形成[16]。Lopez-Ramirez 等[8]在用KLF2、KLF4來抑制TSP1表達的實驗中發現，當誘導人內皮細胞異位表達KLF2 和KLF4 后，TSP1 表達水平與CCM1 沉默后的水平相似；并發現KLF2 和KLF4 的過表達也可以導致TSP1 mRNA表達水平下降。

綜上所述，KLF2、KLF4 被MEKK3-KLF2/4 信號通路激活后，在EndMT、RhoA/ROCK 信號通路以及TSP1 表達中起到重要的橋梁作用（圖1），是CCM 發生發展的關鍵。在CCM小鼠模型中，KLF2、KLF4基因失活可大大減少CCM 病變的形成，因此，KLF2、KLF4 可作為未來CCM 發病機制信號通路的研究重點。KLF2、KLF4作為新的藥物治療靶點，也可為不可觸及的病變提供新的治療方案，如腦干CCM、多發性CCM或位于功能區的病變。

圖1 CCM 發生發展過程中與KLF2/4 有關信號通路圖