單分散二乙二醇羧酸衍生物的工藝優化和雜質研究*

李 虎，張安林， ，許 慧，成 佳，馬 寧

(1 湖南華騰制藥有限公司，湖南 長沙 410006；2 長沙創新藥物工業技術研究院有限公司，湖南 長沙 410006；3 長沙醫學院藥學院， 湖南 長沙 410219)

隨著化學工業和醫藥研發的飛速發展，全球范圍內對藥品的質量要求也水漲船高，使用多分散性的PEG修飾的藥物分子已經逐漸不能滿足生物醫藥市場對藥物的高質量需求。而使用具有單一成分的單分散PEG代替多分散PEG是解決這一困難的行之有效的途徑。單分散PEG的合成方法主要分為四類：單端延伸法、雙端延伸法、鏈單端倍增法以及鏈雙端倍增法。它們的合成純度很高，但分子量越高的PEG的官能團化往往步驟較長，并且純化都十分困難[8-10]。這是因為傳統的單分散PEG合成方法一般在鏈延長和官能化過程中存在較為復雜的保護/脫保護過程，并且分離純化需要通過柱層析方法，為了除去同系物雜質往往會降低分離速度以致合成效率降低。

單分散PEG是目前在生物醫學領域中使用越來越多的藥物修飾劑，適用于單抗等生物大分子修飾的單分散PEG具有非常重要的應用價值。單分散PEG的官能團化，能夠為生物醫藥以及材料科學提供諸多十分有價值的中間體[11-13]。所以開發一系列高效、經濟、實用的單分散PEG的制備方法來滿足生物藥的快速發展已經迫在眉睫。本文研究了二乙二醇雙官能團化乙酸的合成方法，其工藝如圖1所示，同時開發出一套衍生化分析方法對其純度和雜質進行了分析表征。

圖1 二乙二醇雙羧酸的合成工藝Fig.1 Synthesis of diethylene glycol dicarboxylic acid

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

400 MHz牛津中科高分辨核磁共振波譜儀；Waters e2695型高效液相色譜；二乙二醇,陶氏化學(中國)有限公司；溴乙酸叔丁酯,國藥集團化學試劑有限公司；濃鹽酸,科隆化學品有限公司；其他常用試劑規格均為市售分析純。

1.2 CM-PEG2-CM 3的合成

堿A為40%氫氧化鈉溶液(40%NaOH aq.)，固體氫氧化鈉(NaOH)，氫化鈉(NaH)，叔丁醇鉀(t-BuOK)，1，8-二氮雜雙環[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)中的一種。溶劑B為四氫呋喃(THF)，N-甲基吡咯烷酮(NMP)， N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中的一種。

將10 g(0.094 mol，1 eq)二乙二醇加入到500 mL反應瓶中，加入200 mL溶劑B，于20 ℃攪拌下加入堿A(3 eq)，然后滴加溴乙酸叔丁酯40 g(0. 207 mol，2.2 eq)，反應體系繼續攪拌12 h，TLC檢測反應結束。加入150 mL水，然后用乙酸乙酯200 mL×2萃取，有機相用無水硫酸鈉干燥，將有機相減壓蒸除溶劑得到粗品，粗品經柱層析純化后得到化合物2。1H NMR(400 MHz， CDCl3) δ 4.02(s， 1H)， 3.79～3.63(m， 1H)， 1.47(s， 1H)。

將2(10 g)加入到100 mL反應瓶中，加入4 M鹽酸溶液，反應體系升溫至65 ℃，攪拌6 h。冷卻至室溫，加入50 mL乙酸乙酯洗滌一次，再用50 mL二氯甲烷洗滌一次。減壓蒸除水分，得到6 g產品CM-PEG2-CM(3)，淡黃色粘稠液體，收率：90%。1H NMR(400 MHz， D2O) δ 4.14(s， 1H)， 3.66(d，J=7.9 Hz， 1H)。

1.3 CM-PEG2-CM的衍生化分析方法

將22.2 mg的CM-PEG2-CM溶解在1 mL二氯甲烷中，加入64.5 mg的DIPEA，充分攪拌后緩慢滴加29.8 mg的 SOCI2溶液(溶解在2 mL二氯甲烷中)攪拌2 h。然后將42.8 mg芐胺加進反應體系繼續反應30 min，結束后將反應液用乙腈轉移到100 mL容量瓶中，定溶至100 mL后直接進樣進行HPLC檢測分析。

2 結果與討論

2.1 堿和溶劑對化合物2收率的影響

二乙二醇與溴乙酸叔丁酯通過親核取代反應獲得化合物2，該步反應是整個反應的最重要步驟，反應的收率和所得化合物2的純度將對產品3的質量產生決定性影響。然而由于溴乙酸叔丁酯的亞甲基氫較為活潑，導致溴乙酸叔丁酯參與的親核取代反應普遍由于副反應而導致收率極低[14]，而見諸報道的親核試劑經常選擇氫化鈉，并且氫化鈉用量往往較大，氫化鈉的易燃性決定了該反應體系存在重大安全隱患而無法實現規模化工業生產，所以篩選合適的親核反應體系對于化合物3的產業化意義重大。為了篩選最佳的反應條件，對反應使用的堿和溶劑做了對比試驗，結果如表2所示，從表2中看出使用氫化鈉做堿和NMP作為溶劑可以得到最高的收率為35%，將氫化鈉替換成普通的堿NaOH后，中間體2的收率達到了32%。雖然比氫化鈉參與的反應收率低一些，但是安全性獲得極大優化。

表2 堿和溶劑對收率的影響Table 2 Influence of alkali and solvent on yield

2.2 堿和溶劑對雜質的影響

在產品3的工藝質量控制方面，一方面是產品收率，另一方面更重要的是雜質鑒定和控制。我們對表1所述條件下的所有批次產物進行了HNMR、LC-MS以及衍生化HPLC分析。發現各條件下獲得的化合物3的HNMR圖譜基本沒有區別，但是如圖2所示LC-MS分析發現，條件1～15對應獲得的產品3均除了有目標特征離子峰223.2 m/z之外，還或多或少出現了一個明顯的雜質離子峰281.0 m/z。我們推測該雜質對應的結構式如圖2中所示的3a，它是合成工藝中第一步反應產生的副產物2a經水解得到的。

圖2 產品3的LC-MS分析圖譜Fig.2 LC-MS analysis of product 3

我們選取部分條件下得到的產品3進行芐胺衍生化HPLC分析，結果如圖3所示。產品3的芐胺衍生物保留時間在16.1 min，而所有條件下獲得的產品3的衍生化主要涉及兩個雜質，保留時間分別在14.9 min和17.3 min。14.9 min經分析是產品3的單芐胺衍生物，是衍生化不完全造成的，故14.9 min對應的衍生化雜質可以忽略，而17.3 min對應的是雜質3a的芐胺衍生物，很明顯該雜質與主峰保留時間十分接近，對應的雜質3a在產品3中亦很難實現純化分離。從圖3a和圖3b中可以看出，40% NaOH條件下對應獲得的產物3中會出現大量雜質3a(6.2%)，而此雜質在95%NaOH條件下對應的產物中發現明顯減少(1.32%)，同時在其它堿作為親核試劑條件下對應產品中的該雜質含量均低于0.5%(圖3c～g)。我們推測是反應步驟1中，由于有水的存在，反應中會產生雜質2a，此雜質在化合物2的檢測中難以發現，后經水解步驟后產生雜質3a，3a與產品3的理化特征幾乎一模一樣，難以鑒別，同時無法通過常規方法將3a從產品3中分離除去。而使用氫化鈉和叔丁醇鉀對應得到的產品之所以含有的雜質較少(圖3d～e)，主要是因為氫化鈉和叔丁醇鉀可以和水發生反應，從而起到對反應體系除水的目的，相應產生較少的雜質。圖3a～b圖譜對應的工藝使用氫氧化鈉水溶液作為堿，中間體2以及過量的溴乙酸叔丁酯會在堿性條件下部分水解，水解產物之間再次發生反應而產生雜質中間體2a，并在后續反應中水解為雜質3a。工藝中水的存在不僅影響產物純度也極大降低產物收率。可見該工藝的關鍵雜質控制條件為水分，即需要在嚴格無水條件下才能獲得高純度的產品3。

圖3 產品3的芐胺衍生化HPLC分析圖譜Fig.3 HPLC analysis of benzylamine derivatization of product 3

2.3 溫度對化合物2收率的影響

由于工藝步驟中反應條件氫氧化鈉與氫化鈉對應的產物收率相當，但在安全性和產業化前景上，氫氧化鈉比氫化鈉更具有優勢。所以反應條件上選擇固體氫氧化鈉作為最佳條件，在嚴格控制反應體系水分的基礎上研究了溫度對反應的影響。從表3中看出在25 ℃和35 ℃條件下核心中間體2的收率基本沒有變化，但隨著溫度的進一步升高，收率明顯減少。所以此反應的溫度在25～35 ℃為宜。

表3 NaOH反應條件下溫度對收率的影響Table 3 Effect of temperature on yield under reaction condition NaOH

3 結 論

本文以二乙二醇和溴乙酸叔丁酯為原料，通過對反應條件的篩選，確定最優反應條件為固體氫氧化鈉為堿，N-甲基吡咯烷酮為反應溶劑，25～35 ℃為反應溫度，制得二乙二醇雙羧酸衍生物，并對其做了表征。該工藝安全可靠，產品雜質含量較低，適合工業化生產。