多酚類物質與果汁口味關系

賀增洋 李玉秀 朱慶生 - 寧 勇 朱曉蘭

(1. 安徽中煙—中國科大先進技術研究院化學與燃燒聯合實驗室，安徽 合肥 230066；2. 安徽中煙工業有限責任公司技術中心，安徽 合肥 230088；3. 中國科學技術大學煙草與健康研究中心，安徽 合肥 230052；4. 安徽建筑大學經濟與管理學院，安徽 合肥 230601)

酚類物質是水果及其加工制品中重要的生物活性物質[1-2]，不僅具有很高的營養價值，同時也是引起味覺苦味和澀味的物質，與水果及其加工制品的營養、保健功能和感官品質等密切相關。果汁中的多酚類物質主要包括酚酸類、黃酮類以及少量的芪類和木酚素[3]。常見的酚酸類物質有羥基苯甲酸的羥基化衍生物、苯乙酮及苯乙酸的衍生物和苯丙烯酸、香豆素類、肉桂酸類的衍生物。大多數果汁中還存在一種重要的肉桂酸類衍生物——綠原酸，是由咖啡酸和奎尼酸縮合形成的酯。酚酸類物質占飲食中多酚的1/3，在所有的植物中都存在，在酸味的水果中含量更高。黃酮類化合物是指分子結構上具有C6—C3—C6特點的一類多酚化合物，包括黃酮類、黃酮醇類、黃烷酮類、黃烷醇類、黃烷酮醇類、查耳酮類及花色素類等，直接影響植物和水果的顏色和味道[4]。芪類目前最被廣泛研究的是白藜蘆醇，在植物中起到抗真菌和抗病毒的作用；木酚素則主要存在于全谷物和雜豆類食物的種皮當中，水果中較為少見[5]。多酚類物質具有很多藥理特性，包括抗炎、抗氧化、抗癌、抗菌和抗動脈粥樣硬化等活性[6-7]。

水果中的多酚物質不僅具有很高的藥用價值，也是水果成熟度的重要指標之一，其種類及含量與新鮮水果及其加工制品(如果汁、果酒等)的風味、色澤及穩定性密切相關[8-9]。多酚類物質對果汁的口味容易造成不良影響，其中的酚酸類物質與口腔黏膜或唾液蛋白結合并生成沉淀，引起粗糙折皺的收斂感和干燥感即澀味，而且多酚物質的存在影響果汁的色澤，酚酸物質中大量的酚羥基在多酚氧化酶存在的條件下，容易氧化成深色的醌類物質，使果汁產品顏色加深。此外，多酚物質的存在還影響果汁的澄清度，游離酚酸在酸性條件下會發生自縮合現象，產生沉淀，穩定性變差。有些水果如蘋果、葡萄、柿子、獼猴桃、黑莓、山楂、枇杷、石榴、橄欖等酚酸類物質含量較高，尤其在果實的果皮和果核中，因此不同種類水果所生產的果汁在酚類物質含量和組成上存在較大差異，如葡萄和紅葡萄酒等富含白藜蘆醇，番茄、桃、櫻桃、藍莓、芒果、甜橙等含有兒茶素，葡萄、柿蒂、石榴等含有沒食子酸等[10-11]。研究擬采用HPLC-MS/MS法檢測常見的14種果汁中多酚物質的含量，依據味覺的7個因素(酸、甜、苦、咸、鮮、澀和辣)對果汁樣品進行感官評價，通過聚類分析和輪廓圖法對果汁口感進行分類和差異性分析，并就果汁中多酚物質的含量與其口味中澀味和苦味進行相關性分析，以期為果汁中口味物質研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葚、番茄、葡萄、百香果、藍莓、菠蘿蜜、無花果、梨汁、杏子、蘋果、櫻桃、楊桃、草莓和甜橙14種濃縮果汁：廣東省茂名市德威圣科技有限責任公司；

乙腈、甲醇、甲酸：色譜級，美國天地有限公司；

沒食子酸、新綠原酸、兒茶素、綠原酸、表兒茶素、對羥基苯甲酸、咖啡酸、丁香酸、阿魏酸、阿魏酸-d3(內標物)、蘆丁、根皮苷、香豆素、槲皮苷、白藜蘆醇和肉桂酸等標準品：純度>99.5%，北京迪馬工業有限公司；

其余常規試劑：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

液相色譜儀—質譜聯用儀：Agilent 1100系列/4000 QTRAP型，配備ZORBAX SB-C18超高壓柱(4.6 mm×100 mm，3.5 μm)，美國Agilent公司；

循環水式真空泵：SHZ-D(III)型，鞏義市豫華儀器有限公司；

真空干燥箱：ZK-82B型，上海市實驗儀器總廠；

電子天平：AEG-220型，日本Shimadzu公司；

氮氣吹干儀：BF2000型，北京八方世紀有限公司；

離心機：LG10-2.4A型，北京醫療器械公司；

數控超聲儀：KQ-100DB型，江蘇昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 果汁樣品中多酚物質的HPLC-MS/MS分析方法

1.3.1 樣品前處理 依據文獻[4,12—13]，采用HPLC-MS/MS法分析果汁樣品中多酚物質含量，具體前處理：準確稱取1 g濃縮果汁樣品于5 mL的離心管中，先后加入200 μL內標液(阿魏酸-d3，質量濃度100.0 μg/mL)和5 mL的乙醇，超聲20 min，0.45 μm微膜過濾后用氮吹儀濃縮至1 mL，用HPLC-MS檢測。

1.3.2 色譜—質譜條件 分析柱為ZORBAX SB-C18超高壓柱(4.6 mm×100 mm，3.5 μm)；流動相：0.1%的甲酸水溶液(A相)和甲醇(B相)。采用梯度洗脫，洗脫條件為：0～4 min，10% B；4～25 min，10%～100% B；25～26 min，100%～10% B；26～30 min，保持10% B。柱溫35 ℃，流速0.3 mL/min；進樣量為5 μL。質譜條件：電離方式為電噴霧離子化正負離子模式(ESI)；離子源溫度110 ℃；毛細管電壓為4.0 kV；霧化氣壓力為205.8 kPa；干燥氣溫度為350 ℃；干燥氣流速為10 L/min；采用實時多反應檢測模式(MRM)。

1.3.3 定量標準溶液的配制 稱取沒食子酸、新綠原酸、兒茶素、綠原酸、表兒茶素、對羥基苯甲酸、咖啡酸、丁香酸、阿魏酸、阿魏酸-d3、蘆丁、根皮苷、香豆素、槲皮苷、白藜蘆醇和肉桂酸標準品各25.0 mg，加入乙醇溶解并定容25 mL，搖勻，得到一級混合標準溶液，放入4 ℃冰箱備用。取各儲備液適量，用乙醇配置0.05，0.10，0.20，0.40，2.00，5.00，10.00，20.00，40.00，100.00 μg/mL系列混合標準溶液。阿魏酸-d3標準品為內標物，每種混標中均加入內標物阿魏酸-d3，最終濃度為20 μg/mL。

1.4 果汁樣品感官的評價

對收集的2020年生產的14個不同種類濃縮果汁樣品，搖勻后取10 mL用礦泉水按1∶3稀釋，由7名經過品評培訓的專業人員組成評定小組對濃縮果汁樣品的口味特征進行評價[14]。采取10分制，對味覺的7個因素(酸、甜、苦、咸、鮮、澀和辣)的得分按照感官評價評分表(見表1)評分。最后按7種味覺特征有相同權重計算出感官評定綜合得分，其中，單項得分高于4分則認定為某種口味果汁，如苦味或酸味或甜味果汁。感官評定綜合得分≥12分的認定為果汁風味較濃郁樣品。

表1 果汁樣品感官評價評分表

1.5 數據處理方法

采用Excel和Origin Pro 9.0 軟件對數據進行相關圖表處理，采用IBM SPSS Statistics軟件進行相關性分析、聚類分析和回歸分析，聚類方法采用瓦爾德法，即離差平方和法[15]。

2 結果與分析

2.1 果汁樣品的多酚類物質

采用HPLC-MS/MS法對14個不同種類的果汁樣品中多酚類物質進行了檢測，結果如表2所示。對羥基苯甲酸、綠原酸、香豆素和丁香酸是果汁中存在最廣泛的多酚物質，其中香豆素和對羥基苯甲酸幾乎在所有果汁樣品均有檢出。含量最高的是綠原酸類，桑葚果汁不僅綠原酸類(綠原酸和新綠原酸)含量高達684.7 μg/g，而且多酚類物質含量和種類也最豐富，多酚總量高達1 202.8 μg/g，草莓、甜橙和楊桃中多酚種類較少，酚酸類和黃酮類含量都比較低，含量最低的草莓果汁總量僅有41.3 μg/g，因此，不同品種果汁的酚類物質組成和含量顯著不同。研究[8]表明，多酚物質是水果的味道、顏色和營養特性的物質基礎，直接影響水果及其加工食品的口味和質量。酚類物質不僅是不同種類果汁的特征性組分，而且可以通過不同品種果汁的多酚物質組成和含量建立指紋圖譜對果汁樣品進行溯源和甄別真偽[16-17]。

表2 HPLC-MS/MS法測定的果汁類樣品中多酚類物質含量?

2.2 果汁樣品的感官評價及輪廓圖分析

如圖1所示，桑葚、百香果、番茄、葡萄、菠蘿蜜、蘋果和櫻桃7種果汁樣品總得分在12分以上，屬于果味比較濃郁樣品。其中桑葚口味豐富，苦味、澀味和辣味得分都比較高，分別為5.86，4.86，5.43，其次是百香果，酸味非常突出(6.29)。從單一味覺特征來看，大多數果汁樣品如蘋果汁、草莓汁、楊桃、櫻桃、杏汁和梨汁等具有明顯的甜味，其中杏子、梨汁、櫻桃、楊桃和蘋果甜味單項得分均高于5，而部分果汁中酸味得分同時也比較高，口感上屬于甜酸型[18]。

圖1 果汁樣品感官評價總得分圖

為進一步比較14種果汁的不同味覺特征，對不同樣品的味覺特征進行了輪廓圖分析。由圖2可知：① 甜味是所有濃縮果汁中最普遍的口味，9種果汁(草莓、梨、杏子、櫻桃、蘋果、番茄、楊桃、菠蘿蜜和葡萄)都有明顯的甜味，得分較高。葡萄雖然甜度得分與其他果汁接近，但同時有一定的苦味，口感更加豐富。② 同為甜味果汁，但不同果汁口味上仍有差別。櫻桃、草莓、梨和杏均是明顯以甜味為主的果汁，甜味得分占總得分60%以上。番茄和蘋果則是酸甜味特征明顯的果汁，其中蘋果甜味更明顯，而番茄甜度降低，但同時酸味得分更高，風味更濃郁。③ 有5種果汁(藍莓、無花果、甜橙、百香果和桑葚)口感苦味比較明顯，桑葚是苦、澀和辣三味都很突出的樣品，因此與其他果汁樣品差異非常顯著。百香果是唯一以酸味為主要味道的果汁(酸味得分占總得分約50%),與無花果果汁整體形狀一定程度相似，但無花果果汁酸味、甜味、苦味和澀味分值均有下降，藍莓、甜橙與這兩種果汁相比，酸味有減少而苦味略有加強，同時有較明顯的甜味，口味層次更豐富。總體來說，14種果汁可粗分成兩大類，即甜味和苦味，細分成4種類型，分別為甜味果汁(楊桃、草莓、櫻桃、菠蘿蜜、梨汁和杏子)、甜酸味果汁(蘋果和番茄)、苦味果汁(無花果、藍莓、甜橙和百香果)和苦澀味果汁(桑葚)。

圖2 果汁樣品感官評價輪廓圖

2.3 果汁樣品聚類分析

依照7項味覺特征對14個不同果汁樣品進行聚類分析，由圖3可知，當組間距為15時，14個果汁樣品可以劃分為兩個類組：甜味組和苦味組。當組間距為6時，14個果汁樣品被劃分為4個類組，第一類是甜味果汁(樣品為杏、櫻桃、菠蘿蜜、楊桃、梨汁、草莓、番茄和蘋果，其中番茄和蘋果屬于甜中帶酸口味)，第二類為單獨的葡萄果汁樣品，屬于甜中略有苦味，第三類是苦味果汁(樣品為藍莓、無花果、甜橙和百香果)，第四類為單獨的桑葚果汁樣品，屬于苦中有澀味和辣味口味。葡萄果汁雖然歸屬為甜味果汁(甜味得分5.0)，但是同時其苦味得分也較高(3.57)，因此聚類分析時與純甜味果汁、甜酸味果汁的距離要略遠。桑葚果汁因為苦、澀和辣3種口味都很突出，雖歸屬為苦味，但與其他4種口味果汁的距離較遠。這與2.2中輪廓圖分析結果基本一致。

2.4 果汁樣品的多酚物質含量與口感特征的關系

許多果汁具有苦味和澀味，單純的苦味或澀味是不適合的，但在調節味覺和豐富食品的風味等方面有著有益的貢獻。如前所述，苦味和澀味果汁(如桑葚)中多酚含量較多，酸味果汁(如菠蘿蜜、番茄、蘋果和無花果)次之，而純甜味果汁中多酚含量都普遍較低。從分析結果來看，果汁中含量最高的化合物是綠原酸類(綠原酸和新綠原酸)，綠原酸具有抗菌、抗病毒、增高白血球、抗腫瘤、降血壓、降血脂、清除自由基和興奮中樞神經系統等作用，是一類重要的生物活性物質[5]。

圖3 基于7項味覺特征的14種不同果汁樣品使用沃德聯接的譜系圖

對果汁多酚物質的總含量、酚酸類含量、黃酮類含量、綠原酸類含量和游離酚酸類含量與口感中的苦味和澀味得分進行了相關性分析，如表3和圖4所示，多酚類物質的總含量、總酚酸類、總黃酮類、綠原酸類和游離酚酸類與果汁口感特征中的澀味得分均存在不同程度的相關關系，相關系數R2大小為游離酚酸類>總酚酸類>多酚類物質總量>總黃酮類>綠原酸類，游離酚酸類相關性最強，總酚酸類與總多酚類次之，而總黃酮類與綠原酸類最弱。研究[8]表明，酚類物質是水果及其加工制品中引起味覺苦味和澀味的物質，尤其是酚酸類物質易與口腔黏膜結合引起粗糙折皺的收斂感和干燥感即澀味，試驗也進一步證明了其與澀味的密切關系。

表3 果汁樣品的多酚類物質含量與口味中苦味和澀味分值的相關性

PP. 多酚總量 PA. 總酚酸類 FN. 總黃酮類 CHA. 綠原酸類 FPA. 游離酚酸類

酚酸類和黃酮類多酚在構成骨架上相差很大[5]：酚酸類主要是羥基苯甲酸和羥基肉桂酸及其衍生酯；黃酮類多酚(包括兒茶素、表兒茶素、根皮苷、槲皮苷和蘆丁)是分子結構上具有2-苯基色原酮結構(C6—C3—C6)的多酚化合物，其中的羧酸基團已形成縮合苷元結構；而綠原酸類(含綠原酸和新綠原酸)是咖啡酸和奎尼酸縮合形成的酯，也不存在游離的羧酸基團。因此，多酚物質中含游離羧酸基團的酚酸類物質(包括沒食子酸、對羥基苯甲酸、咖啡酸、阿魏酸、丁香酸、肉桂酸、對香豆酸等)對口味中澀味的貢獻更大，綠原酸類與黃酮類多酚則相對影響較小。相比澀味，多酚類物質與苦味也有類似的規律，但相關性明顯減弱，可能是由于苦味的物質基礎不僅有多酚類物質，還包括生物堿和氨基酸等物質[10]。劉文旭等[19]曾研究表明，草莓、黑莓和藍莓小漿果中的多酚物質含量與其抗氧化能力存在顯著性相關。因此，多酚類物質不僅是果汁抗氧化性的物質基礎，同時也是果汁口感特征中引起澀味的主要物質基礎，尤其是游離酚酸類物質。

3 結論

不同水果果汁的多酚物質的組成和含量差別很大，其中苦味和澀味果汁含量較高而純甜味果汁含量最低。依據口感差異，并采用輪廓圖結合聚類分析法將14種果汁分為甜味、酸甜味、苦味和苦澀味四類。在此基礎上，相關分析結果表明果汁中總多酚物質含量、總酚酸含量、總黃酮含量、綠原酸類含量和游離酚酸類含量均與口感中澀味顯著正相關。其中，多酚類物質尤其是游離酚酸類是引起果汁口感中澀味的物質基礎。