枸杞原漿抗氧化及增強免疫活性研究

楊 露 趙 冉 吳鎮槐 余建強,2 楊佳美,2

(1. 寧夏醫科大學藥學院，寧夏 銀川 750004；2. 寧夏特色中醫藥現代化工程技術研究中心，寧夏 銀川 750004)

枸杞子(LyciumbarbarumL.)為茄科植物寧夏枸杞的干燥成熟果實[1]，富含多糖、黃酮和氨基酸等活性成分，具有抗氧化及增強免疫力等功效[2-3]，是中國傳統的藥食兩用中藥材。由鮮榨枸杞子制得的枸杞原漿，因其制備工藝可很大程度地避免干燥或熏制等加工方式而導致的營養成分流失和污染，且與傳統枸杞泡水或泡酒等方式相比，可更充分地保留枸杞子原有的營養成分而倍受消費者青睞[4-6]。

研究[2-3]表明，枸杞子具有良好的抗氧化及增強免疫力活性。Cristiane等[7]通過秀麗隱桿線蟲的存活率探究了枸杞原漿的安全性及抗衰老作用；Liu等[8]采用枸杞汁來調節解毒途徑預防DEHP誘導的肝毒性；Wang等[9]采用枸杞汁來調節機體血糖。其中，抗氧化及增強免疫力功效作為人們關注度極高的健康保健作用，目前尚未見報道。

研究擬參考國食藥監保化[2012]107號《關于印發抗氧化功能評價方法等9個保健功能評價方法的通知》中抗氧化功能評價方法和《保健食品檢驗與評價技術規范》(2003版)對華寶枸杞產業有限公司所生產的枸杞原漿進行抗氧化和增強免疫力功效評價，為更好地推廣利用枸杞原漿及其制劑提供依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

動物：SPF級ICR小鼠，雄性，標準體重，飼養于寧夏醫科大學藥效平臺[溫度(23±2) ℃，相對濕度(55±5)%]，分籠飼養，自由進食進水并每日更換，寧夏醫科大學動物中心；

還原型谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)及總蛋白定量測定試劑盒：南京建成試劑有限公司；

蛋白質羰基測試盒及豚鼠血清：北京索萊寶科技有限公司；

枸杞原漿：華寶枸杞產業有限公司；

綿羊紅細胞(2%，10%，20%)：廣州鴻泉生物科技有限公司；

都氏試劑：廈門海標科技有限公司；

碳酸鈉及印度墨汁：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

全自動酶標儀：Thermo 1510型，美國Thermo Fisher Scientific公司；

全自動樣品冷凍研磨儀：JXFSTPRP-CL型，上海精信實業發展有限公司；

多功能離心機：Z323K型，德國赫墨公司；

電熱恒溫水浴鍋：DK-S24型，北京長源實驗設備廠；

紫外分光光度儀：UV-2501PC型，上海嘉鵬科技有限公司；

電子天平：YP202N型，上海精密科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 抗氧化功效動物試驗設計 隨機選取30只ICR小鼠進行3 d的適應性喂養后，分為正常組、模型組及枸杞原漿低(8.33 mL/kg)、中(16.67 mL/kg)、高(33.33 mL/kg)劑量組。灌胃45 d，期間正常組與模型組給予0.5 mL生理鹽水。最后一次灌胃結束后，除正常組外，其他各組小鼠均在禁食16 h后一次性給予體積分數為50%的食品級乙醇溶液進行灌胃造模處理[10-11]，小鼠灌胃量10 mL/kg·BW(0.1 mL/10 g)。造模6 h后將小鼠處死解剖并迅速取出其肝臟組織，于冰冷生理鹽水中漂洗并用濾紙吸干表面水分后采用生理鹽水將其低溫勻漿，制備質量分數為10%肝臟組織勻漿液，2 000 r/min離心10 min，留上清液待測[12]。

1.3.2 抗氧化活性指標測定

(1) GSH、GSH-Px含量：二硫代二硝基苯甲酸顯色分光光度法。

(2) MDA含量：硫代巴比妥酸法。

(3) 蛋白質含量：BCA顯色分光光度法。

(4) 蛋白質羰基含量：分光光度法[13]。

1.3.3 增強免疫力動物試驗設計 選擇正常組動物模型[10]，隨機選取64只ICR小鼠進行3 d的適應性喂養后，分為2個免疫組(其中免疫1組進行遲發變態反應試驗和血清溶血素試驗，免疫2組進行臟器與體重比值和碳廓清試驗)，每個免疫組ICR小鼠32只，每個試驗組又各設定正常組、枸杞原漿低(8.33 mL/kg)、中(16.67 mL/kg)、高(33.33 mL/kg)劑量組，其中正常組每天灌胃0.5 mL生理鹽水。

1.3.4 增強免疫力功能指標測定

(1) 小鼠體質量和免疫器官指數：直接稱量法。

(2) 遲發型變態反應：足跖增厚法。

(3) 血清溶血素抗體水平：半數溶血素法。

(4) 碳廓清吞噬指數：校正吞噬指數法[10]。

1.4 數據分析

采用SPSS 23.0統計軟件進行數據分析，各組數據均采用均數±標準差表示，多組數據間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，“n”表示“每組小鼠只數”，以P<0.05為具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 枸杞原漿對小鼠體質量的影響

由表1可知，采用枸杞原漿連續灌胃45 d后，各組小鼠的體重變化均無顯著性差異，表明該枸杞原漿對小鼠體重影響不顯著。

表1 枸杞原漿對不同組別小鼠體重的影響

2.2 枸杞原漿對小鼠抗氧化活性指標的影響

由表2可知，小鼠連續灌胃枸杞原漿45 d后，與正常組相比，模型組小鼠肝臟組織內GSH含量顯著低于正常組(P<0.01)，MDA和蛋白質羰基含量均顯著高于正常組(P<0.01，P<0.001)，血清中GSH-Px含量顯著低于正常組(P<0.001)，表明急性酒精肝損傷動物模型造模成功。枸杞原漿低(8.33 mL/kg)、中(16.67 mL/kg)、高(33.33 mL/kg)劑量組小鼠肝臟組織中GSH含量均顯著高于模型組(P<0.05)，MDA和蛋白質羰基含量均顯著低于模型組(P<0.05，P<0.01，P<0.001)，血清中GSH-Px含量均顯著高于模型組(P<0.05，P<0.01)，表明枸杞原漿可迅速提高肝損傷小鼠體內GSH及GSH-Px含量并降低MDA及蛋白質羰基含量，抗氧化作用良好。GSH可以清除體內過氧化氫及脂質過氧化物，其在體內含量越高說明機體抗氧化活力越強[10,14-16]；機體可通過提高GSH-Px這類抗氧化物酶活力來強化機體清除自由基能力[10,17]；當機體遭受脂質過氧化時，由于細胞膜內會產生大量不飽和脂肪酸，以致組織損傷[18]，其主要產物為具有細胞毒性的MDA，其含量的高低反映了氧化應激的強烈程度且與細胞氧化損傷程度呈正相關[19]；機體內氧化劑含量的升高會加速蛋白質的羰基化，致使細胞遭受自由基的攻擊與破壞，體內蛋白質羰基含量越高，可間接地反映出機體抗氧化能力越弱[20-21]。

表2 枸杞原漿對小鼠肝組織中MDA、GSH、蛋白質羰基含量及血清中GSH-Px活力的影響?

2.3 枸杞原漿對小鼠免疫力的影響

由表3可知，經口給予小鼠不同劑量枸杞原漿45 d后，與正常組相比，枸杞原漿各劑量組小鼠臟器與體重的比值差異無統計學意義，表明該枸杞原漿不影響小鼠的生長發育。枸杞原漿低(8.33 mL/kg)、中(16.67 mL/kg)、高(33.33 mL/kg)劑量組小鼠足跖的增厚程度、半數溶血值及碳廓清吞噬指數均顯著高于正常組(P<0.05，P<0.01，P<0.001)，表明枸杞原漿能夠提高小鼠足跖腫脹程度、血清抗體水平及碳廓清吞噬指數，具有良好的增強免疫力作用。遲發性變態反應是當機體被致敏性T細胞刺激時產生的一種細胞免疫反應，小鼠足跖的腫脹程度可直觀反映出遲發性變態反應的強弱[22]；血清溶血素水平通常采用半數溶血值來表示，其水平的高低可反映出機體形成抗體的能力，從而評價機體體液免疫功能能力的強度[23]；機體非特異性免疫功能的強弱與巨噬細胞的吞噬能力呈正相關，碳廓清能力指數則代表巨噬細胞的吞噬能力[24]。因此，碳廓清能力的好壞可反映機體對巨噬細胞吞噬能力的強弱[12]。

表3 枸杞原漿對小鼠免疫力的影響?

3 結論

采用小鼠體內試驗對枸杞原漿進行抗氧化及免疫力活性探究。結果表明，枸杞原漿可降低急性肝損傷模型小鼠體內脂質及蛋白質氧化產物水平，減弱機體因脂質過氧化反應或活性氧引起的細胞損傷及機體氧化損傷，提高體內抗氧化物酶等抗氧化物物質含量，強化體內自由基反應系統的活力；枸杞原漿不影響正常小鼠的生長發育，可增強小鼠體內巨噬細胞吞噬活力，血清溶血素水平及遲發變態反應，促進機體單核—巨噬細胞功能、體液及細胞免疫活性，表現出良好的免疫作用。但有關枸杞原漿中發揮抗氧化及增強免疫力活性的化學成分確定及作用機制還有待進一步探究。