不同品種亞麻籽8種生物活性物質(zhì)含量及其主成分分析

孫 強(qiáng) 王麗艷 荊瑞勇 郭永霞

(1. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，黑龍江 大慶 163319；2. 國家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319)

亞麻籽為亞麻的種子又稱胡麻籽，不僅富含脂肪、蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類和礦物質(zhì)等多種營養(yǎng)成分[1-2]，另外還含有生育酚、木酚素、黃酮、氰化物、植物甾醇等生物活性物質(zhì)[3]。其中木酚素能夠誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[4]，具有抑制人體乳腺癌細(xì)胞生長、預(yù)防經(jīng)期綜合癥、前列腺癌、骨質(zhì)疏松等作用[5-6]。生育酚是一種重要的脂溶性抗氧化劑，能夠保護(hù)低密度的脂蛋白免于脂質(zhì)過氧化，進(jìn)而保持組織器官的完整性[7-9]。另外生育酚能夠抑制血小板增殖和血細(xì)胞粘附[10]，在一定程度上能夠降低患帕金森、阿爾茲海默癥和癌癥等疾病的風(fēng)險[11]。甾醇在抗菌、抗腫瘤和預(yù)防心血管疾病方面有一定的功效[12]。亞麻籽過去主要用來榨油，隨著科學(xué)研究的不斷深入，其營養(yǎng)保健功能越來越引起人們的重視[13]。

通過前人研究發(fā)現(xiàn)，不同國家或產(chǎn)地的亞麻籽中生物活性物質(zhì)含量具有明顯差異[14]，這可能是導(dǎo)致不同的亞麻籽油在改善人類代謝性疾病方面存在不同效果的原因之一[15-16]。在中國亞麻種植品種主要有隴亞、壩亞、寧亞、晉亞等系列品種，亞麻籽品種以及產(chǎn)地的不同可能是導(dǎo)致亞麻籽主要生物活性物質(zhì)組分和豐度差異的主要原因之一[3]。而關(guān)于利用多種生物活性物質(zhì)成分對不同品種亞麻籽進(jìn)行分析研究目前鮮有報道。

研究擬以6個產(chǎn)地的12個亞麻籽品種為研究對象，測定亞麻籽中總酚酸、木酚素、黃酮、總氰化物、植物甾醇、生育酚含量以及體外抗氧化活性DPPH自由基清除能力和FRAP值8個活性成分，并對其進(jìn)行主成分分析，以期為中國亞麻籽深加工提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

亞麻籽：6個產(chǎn)地、12個品種，具體信息見表1。

余品種由黑龍江省科學(xué)院大慶分院提供。

1.2 儀器與試劑

紫外—可見分光光度計：DU800型，美國Beckman Coulter公司；

氣相色譜儀：Agilent 6890型，美國Agilent公司；

超聲波清洗器：Elmasonic E120H型，德國Elma公司；

超高效液相色譜儀：UPLC型，美國Waters公司；

脂肪測定儀：SZC-101型，上海纖檢儀器有限公司；

蘆丁(R-5143)、1,1-二苯基-2-硝基苦肼(DPPH)：95%，美國Sigma公司；

2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)：99%，美國Sigma公司；

γ-生育酚(T-1782)：96%，美國Sigma公司；

6-羥基-2,5,7,8-四甲基苯并二氫吡喃-2-羧酸(Trolox)、5α-膽甾烷：97%，美國Sigma公司；

植物甾醇：95%，西安藍(lán)天生物工程有限責(zé)任公司；

木酚素(SDG)：98%，上海同田生物技術(shù)有限公司。

1.3 測定項(xiàng)目與方法

1.3.1 木酚素含量 參考Eliasson等[17]的液相色譜法，稍做修改。準(zhǔn)確稱取0.25 g脫脂亞麻籽粉，加入40%乙醇溶液5 mL，超聲提取30 min，4 000×g離心20 min，重復(fù)提取3次，合并上清液。加入 0.3 mol/L 氫氧化鈉溶液10 mL，超聲波水解30 min。用3.0 mol/L硫酸溶液調(diào)節(jié)pH值至3～5，雙蒸水定容至25 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后進(jìn)樣分析。

1.3.2 總酚酸含量 參考Koski等[18]的Folin-Ciocaileu比色法，稍加修改。取0.5 mL提取物加入25 mL比色管中，再加入 Folin-Ciocaileu試劑1 mL和飽和碳酸鈉溶液(20 g/100 mL)3 mL，用雙蒸水定容至25 mL，漩渦混勻后，避光靜置1 h，765 nm處測定吸光度值。

1.3.3 黃酮含量 參考Kim等[19]的比色法，稍加修改。吸取1 mL提取物放入10 mL比色管中，分別加入 0.3 mL 的5%亞硝酸鈉溶液和0.3 mL的10%硝酸鋁溶液，混勻后靜置5 min，用甲醇—水(V甲醇∶V水=1∶1)溶液定容，靜置5 min，紫外可見分光光度計在 503 nm 處測定吸光度值。

1.3.4 植物甾醇含量 參考Azadmard-Damirchi等[20]的氣相色譜法，稍加修改。精確稱取0.03 g索氏抽提亞麻籽油放入10 mL具塞離心管內(nèi)，再加入0.5 mg/mL 5α-膽甾烷150 μL和3 mL 的2 mol/L 氫氧化鈉—乙醇溶液，旋渦混勻，于70 ℃恒溫?fù)u床加熱15 min。待室溫冷卻后分別加入1.5 mL正己烷和2 mL雙蒸水，旋渦提取 5 min后1 500×g離心10 min。重復(fù)提取3次，合并上清液，用N2吹干后再加入100 μL的Tri-Sil溶液，超聲輔助衍生化30 min，N2吹干，復(fù)溶于1.5 mL的正己烷，進(jìn)行氣相色譜分析，用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量。

1.3.5 總氰化物含量 按GB 7486—87執(zhí)行。

1.3.6 生育酚含量 參考禹曉等[3]的液相色譜法，稍加修改，精確稱取0.1 g亞麻籽油，分別加入1 mL的0.05 g/mL 維生素C溶液，無水乙醇5 mL和0.5 mL的14.26 mol/L氫氧化鉀溶液，置于70 ℃恒溫?fù)u床上皂化30 min。冷卻至室溫后，加入雙蒸水3 mL，正己烷—乙酸乙酯(V乙酸乙酯∶V正己烷=15∶85)溶液5 mL，旋渦提取5 min 后1 500×g離心15 min。重復(fù)提取3次后合并上清液，用N2吹干，復(fù)溶于100 μL乙腈—甲醇—乙酸乙酯溶液(V乙腈∶V甲醇∶V乙酸乙酯=60∶20∶20)中，3 500×g離心10 min，取上清液進(jìn)樣分析。

1.3.7 DPPH自由基清除能力 參考Szydlowska-Czerniak等[21]的方法，稍作修改。吸取0.5 mL提取物，加入2.5 mL 38.0 μg/mL的DPPH甲醇溶液，漩渦混勻，避光靜置30 min后515 nm處測定吸光度值，以甲醇為空白對照。

1.3.8 總抗氧化能力 參考Szydlowska-Czerniak等[22]的方法，稍加修改。取提取物1.0 mL和溫育后的FRAP工作液2 mL于10 mL比色管中，雙蒸水定容10 mL后旋渦混勻，避光靜置20 min后在593 nm處測定吸光度值。

1.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

1.4.1 隸屬函數(shù)值

(1)

式中：

U(Xj)——第j個綜合指標(biāo)的隸屬函數(shù)值；

Xj——第j個綜合指標(biāo)，j=1，2，…，n；

Xmin、Xmax——第j個綜合指標(biāo)的最小值與最大值[23]。

1.4.2 權(quán)重

(2)

式中：

Wj——第j個綜合指標(biāo)的權(quán)重；

Rj——第j個綜合指標(biāo)的貢獻(xiàn)率[24]。

1.4.3 綜合評價值

(3)

式中：

D——不同品種亞麻籽的綜合評價值[25]。

1.4.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

(1) 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與整理：采用Excel 2013統(tǒng)計軟件；差異性分析、相關(guān)性分析和主成分分析(PCA)采用R語言，自編程序。

(2) 聚類分析：采用SPSS 20.0數(shù)據(jù)分析軟件，采用分析中分類下的系統(tǒng)聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物活性物質(zhì)測定與分析

由表2可知，不同品種亞麻籽所含木酚素的差異最大，含量為281.35～931.33 mg/100 g；總酚酸含量為278.32～467.43 mg/100 g；黃酮含量為34.01～68.03 mg/100 g，與Oomah等[26]報道的研究結(jié)果基本一致(35～71 mg/100 g)；植物甾醇含量為351.21～601.37 mg/100 g；總氰化物含量為6.34～12.06 mg/100 g；生育酚含量為8.86～17.62 mg/100 g；12個品種亞麻籽提取物體外抗氧化活性也有一定的差異，DPPH自由基清除率為5 031.26～8 155.29 μmol Trolox/100 g，低于美國的亞麻籽抗氧化活性(12 000 μmol Trolox/100 g)[27]；FRAP值為8 342.67～14 864.39 μmol Trolox/100 g。8種生物活性物質(zhì)最大值與最小值之間均存在顯著性差異。8種生物活性物質(zhì)的變異系數(shù)不同，木酚素的變異系數(shù)最大為41.55%，說明亞麻籽品種對木酚素含量影響最大，DPPH自由基清除率的變異系數(shù)最小為13.07%，說明亞麻籽品種對DPPH自由基清除率的影響最小，通過變異系數(shù)大小可知，不同亞麻籽品種對8種生物活性物質(zhì)的影響順序?yàn)槟痉铀睾?總氰化物含量>黃酮含量>植物甾醇含量>總酚酸含量>生育酸含量>FRAP值>DPPH自由基清除率。

表2 8種生物活性物質(zhì)分析?

2.2 生物活性物質(zhì)之間的相關(guān)性分析

由表3可知，木酚素含量與總酚酸含量、黃酮含量之間的相關(guān)系數(shù)為0.581和0.681，呈顯著正相關(guān)；黃酮含量與總酚酸含量的相關(guān)系數(shù)為0.753，呈極顯著正相關(guān)；植物甾醇含量與黃酮含量的相關(guān)系數(shù)為-0.712，呈極顯著負(fù)相關(guān)；黃酮含量與DPPH自由基清除率、FRAP值的相關(guān)系數(shù)為0.712，0.827，呈極顯著正相關(guān)；DPPH自由基清除率與FRAP值的相關(guān)系數(shù)為0.754，呈極顯著正相關(guān)。其余各物質(zhì)之間呈現(xiàn)不同程度的相關(guān)性，相關(guān)性均不顯著。

表3 生物活性物質(zhì)之間的相關(guān)性?

2.3 主成分分析

2.3.1 主成分提取 以8種生物活性物質(zhì)和12個亞麻籽品種構(gòu)成8×12矩陣，利用R語言對其進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見圖1和表4。由表4可知，前3個主成分對應(yīng)的特征值大于1，其方差貢獻(xiàn)率分別為51.270%，18.685%，12.970%，由此可見第1主成分起到了主要作用，累計方差貢獻(xiàn)率達(dá)到82.925%。故可提取出3個主成分，3個主成分定義為PCA,1、PCA,2、PCA,3，由表5可知其對應(yīng)特征向量分別為：

PCA,1=0.333x1+0.378x2+0.480x3-0.335x4-0.247x5+0.020x6+0.398x7+0.428x8，

(4)

PCA,2=0.530x1-0.071x2+0.349x4+0.039x5-0.760x6+0.070x7-0.084x8，

(5)

PCA,3=0.249x1+0.463x2+0.074x3+0.149x4+0.790x5+0.227x6-0.135x7+0.004x8。

(6)

由圖1、表4和表5可知，PCA,1的方差貢獻(xiàn)率為51.270%，在PCA,1的表達(dá)式中，黃酮含量(x3)和FRAP值(x8)的系數(shù)較大，分別為0.480和0.428，可知PCA,1主要由黃酮含量和FRAP值決定；PCA,2的方差貢獻(xiàn)率為18.685%，在PCA,2的表達(dá)式中，木酚素含量(x1)和生育酚含量(x6)系數(shù)較大，分別為0.530和0.760，可知PCA,2主要由木酚素和生育酚含量決定；PCA,3的方差貢獻(xiàn)率為12.970%，在PCA,3的表達(dá)式中，總氰化物(x5)含量和總酚酸(x2)含量系數(shù)較大，分別為0.790和0.463，可知PCA,3主要由總氰化物和總酚酸含量決定。

圖1 主成分圖

表4 主成分的特征值、貢獻(xiàn)率和累計貢獻(xiàn)率

表5 主成分的特征向量與載荷矩陣?

2.3.2 亞麻籽基于生物活性物質(zhì)的綜合評價

(1) 隸屬函數(shù)分析：根據(jù)式(1)可計算出每個品種亞麻籽綜合指標(biāo)(即主成分)的隸屬函數(shù)值(表6)。從表6可知，對PCA,1而言，隴亞8的U(X1)值最大為 1.000，說明隴亞8在PCA,1上評分最高，而伊亞4的U(X1)值最小為 0，說明伊亞4在PCA,1上評分最低；對PCA2而言，壩亞11的U(X2)值最大為 1.000，說明壩亞11在PCA,2上評分最高，而隴亞8的U(X2)值最小為 0，說明隴亞8在PCA2上評分最低；對PCA,3而言，伊亞4的U(X3)值最大為1.000，說明伊亞4在PCA,3上評分最高，而伊亞3的U(X3)值最小為 0，說明伊亞3在PCA,3上評分最低。

(2) 權(quán)重的確定：根據(jù)3個主成分貢獻(xiàn)率的大小，PCA,1

的貢獻(xiàn)率為51.270%，PCA,2的貢獻(xiàn)率為18.685%，PCA,3的貢獻(xiàn)率為12.970%，可用式(2)計算出各主成分的權(quán)重，3個主成分的權(quán)重分別為0.618，0.225，0.156(表6)。

表6 綜合指標(biāo)值、權(quán)重、隸屬函數(shù)值、D值及品質(zhì)排序

(3) 綜合評價：根據(jù)式(3)計算出綜合評價值即D值的大小(表6)，根據(jù)D值對12個亞麻籽品種進(jìn)行排序，其順序?yàn)椋簤蝸?1>寧亞17>壩亞9>隴亞8>輪選2>隴亞10>寧亞16>晉亞7>輪選1>晉亞8>伊亞3>伊亞4。

2.3.3 聚類分析 采用組間聯(lián)接法對表6中的D值進(jìn)行聚類分析，建立了聚類樹狀圖(圖2)，從圖中可以看出聚類分析將其劃分為三大類，其綜合評價值依次降低。第I類包括壩亞11、寧亞17、壩亞9、隴亞8和輪選2；第II類包括隴亞10、寧亞16和晉亞7；第Ⅲ類包括輪選1、晉亞8、伊亞3和伊亞4。

圖2 聚類樹狀圖

3 結(jié)論

亞麻品種對亞麻籽內(nèi)的生物活性物質(zhì)有一定的影響，主成分分析得出第一主成分主要由黃酮含量和FRAP值決定，第二主成分主要由木酚素含量和生育酚含量決定，第三主成分主要由總氰化物含量和總酚酸含量決定，綜合評分壩亞11最高，具有較高的營養(yǎng)保健價值，聚類分析12個亞麻籽品種可劃分為三大類。該結(jié)論僅針對以上的8種生物活性物質(zhì)得出的，有關(guān)亞麻籽內(nèi)其他生物活性物質(zhì)還有待進(jìn)一步研究。