8種食用菌蛋白及其酶解產物抗氧化活性研究

王耀冉 趙 妍 陳明杰 魏晨穎 查 磊 李治平

(1. 上海市農業科學院食用菌研究所上海市農業遺傳育種重點開放實驗室，上海 201403； 2. 上海海洋大學食品學院，上海 201306)

自由基在人類正常生理反應中不斷產生，且具有多種功能，如信號傳導、抗感染[1-2]等。然而，過量的自由基會引發氧化應激從而改變DNA、蛋白質和脂質的結構并影響信號轉導，因此，自由基在癌癥、動脈粥樣硬化、糖尿病和高血壓等人類疾病的病因中起著至關重要的作用[3]。抗氧化劑則可通過干預氧化應激介導的途徑來減少生物分子的氧化損傷[4]。

抗氧化肽屬天然蛋白質，是通過體內的胃腸道消化、體外酶解或微生物發酵后釋放出來的生物活性肽，在機體抗氧化中起著重要作用。如從金槍魚骨架蛋白水解獲得的抗氧化肽APTBP可顯著抑制亞油酸乳液體系中脂質的過氧化[5]；由鴨蛋卵清蛋白制備的酶解產物同時具有抗氧化和免疫調節的活性[6]；油豆角蛋白酶解產物具有防治炎癥和與氧化相關疾病的作用[7]。

根據美國農業部提供的數據[8]顯示，食用菌中蛋白質含量豐富，高于大多數蔬菜。大量研究[9-11]也證實食用菌富含多種抗氧化劑，包括多糖、酚類、蛋白質、多肽、麥角甾醇等。因此，食用菌為抗氧化肽的發現提供了理想的物質基礎。據Zhou等[12]、Erjavec等[13]綜述，食用菌含有豐富的生物活性蛋白質尤其是酶已被廣泛研究，然而關于食用菌源生物活性肽的研究報道很少。研究擬利用堿性蛋白酶對8種食用菌蛋白進行酶解，并綜合評價食用菌蛋白及其酶解產物的抗氧化活性，分析酶解產物的氨基酸組成，為食用菌源抗氧化肽的進一步開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

香菇、平菇、杏鮑菇、紅菇：上海市佳客多超市；

大球蓋菇、草菇、白玉菇、蟹味菇：上海市農業科學院食用菌研究所；

堿性蛋白酶：200 U/mg，上海麥克林生化科技有限公司；

DPPH自由基清除能力試劑盒：蘇州格銳思生物科技有限公司；

ABTS自由基清除率檢測試劑盒、Bradford蛋白濃度測定試劑盒：上海碧云天生物技術有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

恒溫水浴鍋：HWS-24型，上海一恒科技有限公司；

多功能酶標儀：TECAN Infinite 200 Pro型，瑞士TECAN公司；

離心機：R-134 a型，德國Eppendorf公司；

超純水機：Milli-Q Reference A+型，德國MerckMillipore公司；

氨基酸自動分析儀：Hitachi L-8900型，日立有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品準備 將新鮮的食用菌子實體清洗干凈，切片后于40 ℃烘箱中烘干至恒重，磨成粉過60目篩。粉末用密封袋包裝后于-80 ℃保存。

1.2.2 蛋白質的提取 將食用菌粉與超純水按照m食用菌粉∶V超純水=1∶10的比例混勻，靜置4 h。將漿液在4 ℃、8 000 r/min離心20 min，取上清液，加入80%硫酸銨，4 ℃、8 000 r/min離心20 min獲得沉淀物。將沉淀物用雙蒸水溶解，轉移至透析袋(10 kDa)中，在4 ℃下用蒸餾水透析48 h脫鹽，將透析液凍干并儲存于-80 ℃超低溫冰箱內。

1.2.3 蛋白酶解產物的制備 將食用菌蛋白質溶解于雙蒸水中，調節溫度與pH至堿性蛋白酶最佳作用條件(45 ℃、pH 7.5)，平衡30 min。按照底物質量的4%添加堿性蛋白酶，酶解4 h后在90 ℃下加熱15 min以終止反應，8 000 r/min離心15 min，取上清液凍干得到蛋白酶解產物。

1.2.4 蛋白濃度的測定 按Bradford蛋白濃度測定試劑盒要求測定。取5 μL不同濃度的牛血清蛋白(BSA)加到96孔板中；取5 μL樣品到96孔板中；各孔加入250 μL G250染色液；用酶標儀測定595 nm處吸光度值；繪制標準曲線并根據標準曲線計算樣品蛋白質的濃度。

1.2.5 SDS-PAGE凝膠電泳 將16 μL樣品與4 μL上樣緩沖液混合，沸水浴中加熱4 min，冷卻至室溫。取10 μL 混合液上樣至凝膠(質量分數10%)上進行電泳，結束后用考馬斯亮藍染色1 h，然后用脫色液脫色至蛋白條帶清晰可見，并在凝膠成像儀上拍照分析。

1.2.6 氨基酸組成分析 稱取食用菌蛋白酶解液凍干粉20 mg，加入0.5 mL 0.1 mol/L的鹽酸，10%三氯乙酸，在研磨儀60 Hz下研磨3 min，超聲提取15 min，4 ℃、12 000 r/min 離心30 min，取上清液，放入氨基酸自動分析儀進行檢測。

1.2.7 抗氧化活性測定

(1) ABTS自由基清除活性(ARSA)：配制ABTS自由基工作液，在96孔板中，每孔加入20 μL過氧化物酶工作液，10 μL樣品或不同濃度Trolox標準溶液，170 μL ABTS工作液。室溫下孵育6 min，測定414 nm 處吸光度值，根據標準曲線計算ARSA值。

(2) DPPH自由基清除活性(DRSA)：在離心管中分別加入150 μL樣品溶液，150 μL乙醇DPPH溶液，混勻后在室溫下避光靜置30 min，12 000 r/min離心5 min，測定517 nm處吸光度。利用標準品繪制標準曲線，根據樣品測得的吸光度來計算DRSA值。

(3) Fe2+螯合率：參照馬夢嬌[14]的方法。在1 mL樣品溶液中加入3.7 mL雙蒸水、0.1 mL 2 mmol/L的FeCl2溶液和0.2 mL 5 mmol/L菲咯嗪，25 ℃下反應10 min，測定562 nm處吸光度A1。蒸餾水代替樣品測得吸光度為A0，蒸餾水代替菲咯嗪測得吸光度為A2。按式(1) 計算Fe2+螯合率。

(1)

式中：

C——Fe2+螯合率，%；

A1——樣品溶液的吸光度值；

A2——蒸餾水代替菲咯嗪測得的吸光度值；

A0——蒸餾水代替樣品測得的吸光度值。

(4) 還原力的測定：參照Dong等[15]的方法并略作修改。往500 μL樣品中添加500 μL 0.2 mol/L 磷酸緩沖液(pH 6.6)和500 μL 10 g/L鐵氰化鉀，將混合物于50 ℃下水浴20 min，加入500 μL 100 g/L三氯乙酸，8 000 r/min離心10 min得上清液。將500 μL上清液、500 μL雙蒸水和100 μL 1 g/L氯化鐵溶液混合，在室溫下反應10 min，測定700 nm處溶液的吸光度。吸光度越大說明樣品的還原能力越強。

1.3 數據分析

所有試驗均重復3次。使用SPSS軟件進行數據分析，P<0.05時差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 SDS-PAGE電泳圖譜分析

由圖1可知，未水解的蛋白質由10～175 kDa及以上的分子量條帶組成。將食用菌的蛋白質條帶與其酶解產物的條帶進行對比，發現堿性蛋白酶可有效地將8種食用菌蛋白水解為更小分子量的肽段甚至是氨基酸。

M. 標準蛋白marker 1，3，5，7，9，11，13，15. 分別為大球蓋菇、香菇、草菇、紅菇、白玉菇、蟹味菇、平菇、杏鮑菇蛋白 2，4，6，8，10，12，14，16. 分別為大球蓋菇、香菇、草菇、紅菇、白玉菇、蟹味菇、平菇、杏鮑菇蛋白酶解產物

2.2 酶解產物氨基酸組成分析

據報道[16]，His具有很強的抗氧化活性，這與其供氫能力、脂質過氧化自由基捕捉和咪唑基團的金屬離子螯合能力有關。由表1可知，平菇蛋白酶解產物中His含量最高，為(10.85±0.19) mg/g，表明其可能具有較好的抗氧化活性。研究[17-18]表明，疏水性氨基酸增強了多肽在脂質中的溶解性，從而增強了多肽與自由基的相互作用或通過疏水締合進入靶器官的作用；帶負電荷的氨基酸可以賦予多肽較高的抗氧化活性，這些電子可以用來猝滅自由基；芳香族氨基酸通過供氫來穩定缺電子的自由基，這一特性可改善多肽的自由基清除活性。草菇蛋白酶解產物的疏水性氨基酸、負電荷氨基酸以及芳香族氨基酸含量在8種食用菌中均最高，分別為(209.95±4.95),(115.89±2.32),(57.86±1.74) mg/g。草菇蛋白酶解產物還含有豐富的必需氨基酸，而且作為很多食物的第一限制性氨基酸的Lys含量也最高。因此，草菇蛋白酶解產物有著良好的營養價值和抗氧化潛力。

表1 8種食用菌蛋白酶解產物的氨基酸組成?

2.3 食用菌蛋白及其酶解產物的抗氧化活性

2.3.1 ABTS自由基清除能力 由圖2可知，8種食用菌的蛋白酶解產物比未酶解蛋白質ABTS自由基清除能力高，其中草菇蛋白水解產物的ABTS自由基清除能力最高，為(6.97±0.27) mmol Trolox/L。這表明蛋白質經酶解后，ABTS自由基的抑制率顯著增加。

2.3.2 DPPH自由基清除能力 由圖3可知，8種食用菌蛋白酶解產物對DPPH自由基的清除能力均顯著高于其各自的蛋白質，其中紅菇蛋白酶解產物的DPPH自由基清除能力最高，為(5 668.22±6.16) μg Trolox/g。草菇和平菇蛋白酶解產物也具有較高的DPPH自由基清除能力，分別為(5 140.45±5.35) μg Trolox/g和(4 934.66±50.70) μg Trolox/g。蛋白質經酶解后可能會產生更多的生物活性底物，這些底物提供電子并與自由基反應，將其轉化為更為穩定的物質，從而終止了自由基鏈反應[19]，與GHRIBI等[20]的研究結果一致。

2.3.3 Fe2+螯合率 過渡金屬離子(例如Fe2+和Cu2+)是生成自由基的強力劑，這些自由基可以催化活性氧的生成，例如羥自由基和超氧陰離子自由基等[21]。金屬離子的存在會很快消耗抗氧化劑，導致脂質過氧化和DNA損傷[22]。Fe2+可與菲咯嗪形成復合物，在螯合劑存在的情況下，復合物的形成被破壞，導致復合物的紅色減少[23]。由圖4可知，食用菌蛋白酶解產物的Fe2+螯合能力高于食用菌蛋白質，其中草菇蛋白酶解產物的Fe2+螯合能力最高(79.86±0.45)%。陽性對照EDTA的Fe2+螯合率為(99.93±0.01)%。多肽具有較強的Fe2+螯合能力可能是由于肽鍵的斷裂暴露出了更多的酸性和堿性氨基酸，這樣側鏈的羧基和氨基可以結合Fe2+[24]。

2.3.4 還原力 根據抗氧化劑的還原能力不同，測試溶液由黃色變成不同深淺的綠色和藍色[25]。如圖5所示，陽性對照GSH還原力最高為2.720±0.018，食用菌蛋白及其酶解產物的還原力顯著低于GSH，其中草菇蛋白酶解產物的還原能力最高為0.350±0.001。這些食用菌蛋白酶解產物還原能力的不同，可能與不同的氨基酸側鏈基團有關，隨著蛋白質酶解的進行，具有電子密集區域的氨基酸側鏈基團會更多地暴露出來。此外，多肽和游離氨基酸作為額外的電子和質子源可以維持還原電位[26]。具有還原能力的化合物可以作為初級和次級抗氧化劑，因為它們屬于電子供體，很容易減少脂質過氧化過程中的中間產物自由基，這些抗氧化還原劑的存在將Fe3+/鐵氰化物復合物轉化或還原為亞鐵形式(Fe2+)。而Fe2+的濃度由基于700 nm處形成的普魯士藍檢測出來[27]。

1. 大球蓋菇 2. 香菇 3. 草菇 4. 紅菇 5. 白玉菇 6. 蟹味菇 7. 平菇 8. 杏鮑菇

1. 大球蓋菇 2. 香菇 3. 草菇 4. 紅菇 5. 白玉菇 6. 蟹味菇

1. 大球蓋菇 2. 香菇 3. 草菇 4. 紅菇 5. 白玉菇 6. 蟹味菇

1. 大球蓋菇 2. 香菇 3. 草菇 4. 紅菇 5. 白玉菇 6. 蟹味菇

3 結論

以蒸餾水作為提取溶劑，采用硫酸銨沉淀法提取蛋白質，用堿性蛋白酶對8種食用菌(香菇、平菇、杏鮑菇、紅菇、大球蓋菇、草菇、白玉菇、蟹味菇)蛋白進行酶解，發現草菇蛋白酶解產物的抗氧化活性最強，DPPH自由基清除能力為(5 140.45±5.35) μg Trolox/g，ABTS自由基清除能力為(6.97±0.27) mmol Trolox/L，Fe2+螯合率為(79.86±0.45)%，還原力為0.350±0.001。

對食用菌蛋白酶解產物進行研究有助于開發低價值蛋白質在功能性食品或化妝品領域的潛在應用。食用菌富含優質蛋白質，以此為源制備生物活性肽，可以進一步提升食用菌蛋白的高值化應用。在后續的研究中，還需要對蛋白酶解產物進行純化和鑒定，并開展細胞和體內的試驗以探究其可能的作用機制。