腸缺血再灌注損傷誘導Cajal間質細胞凋亡的機制研究

車 軒，郭依然，趙國杰，喬光超，吳國華，馮運章

(邯鄲市中心醫院 1.普外七科；2.教學科,河北 邯鄲056001)

小腸是最易受缺血再灌注損傷的器官之一，在失血性休克或小腸移植中極易受到腸缺血再灌注損傷[1]。Cajal間質細胞在胃腸運動中起重要調節作用，其中一個亞群位于肌間神經叢(ICC-MY)水平，發揮著起搏細胞的作用，在小腸中產生和傳播慢波[2]。另一個與深肌叢(ICC-DMP)密切相關，在腸道神經系統對胃腸道平滑肌的輸入中起中介作用[3]。受體酪氨酸激酶(Kit)，被認為是Cajal間質細胞的發育、分化和功能維持所必需的。最近的研究還表明，Kit表達下調可能與小腸缺血再灌注損傷引起的胃腸動力障礙有關[4]。其他研究也顯示，腸道手術操作和胃腸道疾病如腸梗阻后Kit免疫陽性的喪失，這可能是腸動力功能障礙相關的潛在機制之一[5]。然而，在缺血再灌注損傷后，在肝臟、腎臟、腸道和肺中可觀察到明顯的細胞凋亡，但尚不清楚Cajal間質細胞是否也參與了腸缺血再灌注損傷。本研究探討了腸缺血再灌注損傷是否能誘導Cajal間質細胞凋亡及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

40只6-8周齡雄性豚鼠，體質量300-350 g，購于河北醫科大學生物醫學工程中心，生產許可證號：SCXK(冀)2019-001。所有豚鼠均飼養在SPF級動物房中,室溫(23±2)℃，相對濕度(40%-70%)，晝夜循環12 h,豚鼠可自由進食、飲水，適應性喂養一周。

1.2 腸缺血手術方法

豚鼠在麻醉后進行手術，取正中切口剖腹，分別結扎右結腸動脈降支與回腸動脈升支之間、回腸降支與最后一條回腸動脈之間、腸系膜上動脈近端和遠端空腸動脈之間的血管弓，阻斷側支血流。同時，為了阻斷腸壁內的側支循環，在空腸和回腸末端加用血管微夾，使其與血管拱部處于相同的結扎水平。然后用血管夾閉右側結腸動脈近端的腸系膜上動脈，右結腸動靜脈和回結腸動靜脈也進行閉塞。在計劃的缺血時間結束后，取出血管微夾，通過腸顏色由白色變為粉紅色和腸系膜動脈搏動恢復來確認小腸的血液再灌注。將小腸回納到腹部，切口用兩層連續的3-0絲線縫合。

1.3 分組

將40只豚鼠分為實驗組和假手術Sham組。實驗組豚鼠解除缺血后分別再灌注6 h(6 h 組，n=8)、12 h(12 h 組，n=8)、7 d(7 d組，n=8)和14 d(14 d組，n=8)，分別在腸缺血手術結束后，再灌注的第6 h、12 h、7 d、14 d處死。假手術Sham組(Sham組,n=8)：除血管夾閉外，其他處理方式同前。豚鼠處死后取回腸組織進行實驗。

1.4 病理組織學檢測

切除豚鼠回腸，用PBS沖洗腸道內容物。將小腸用丙酮充氣30 min，沿腸系膜切開取出黏膜，在解剖顯微鏡下制備含有ICC-MY的縱向平滑肌層和圍繞深肌叢的與Cajal間質細胞相關的環狀平滑肌層，進行顯微鏡下Cajal間質細胞觀察。將腸組織固定在4%多聚甲醛溶液中，石蠟包埋后，取4μm切片，蘇木精-伊紅染色，在光鏡下進行腸黏膜形態觀察。

1.5 TUNEL凋亡檢測

腸組織用4%多聚甲醛固定20 min，用PBS清洗兩次30 min，然后用0.1%Triton X-100在冰上處理20 min。用含有45 μl標記液和5 μl酶液的TUNEL反應緩沖液在37℃黑暗環境中孵育1 h。然后用PBS清洗切片三次，每次15 min，以去除未結合的熒光素-dUTP。立刻在熒光顯微鏡下觀察，激發波長在450-500 nm之間。

1.6 ELISA檢測

PBS沖洗豚鼠腸組織，稱重、剪碎。加入含蛋白酶抑制劑的預冷PBS進行勻漿。吸取勻漿液到離心管，4℃、5 000 g條件下離心10 min，取上清，-80℃保存，避免反復凍融。采用ELISA法檢測TNF-α、乳酸、IL-12、IL-23水平，按照試劑盒說明進行操作。

1.7 Western blot檢測

腸組織勻漿，然后用BioRad蛋白分析試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白質樣品在8%-10%的SDSPAGE上電泳后轉移到硝酸纖維素膜上，5%的脫脂牛奶封閉。將膜與STAT2一抗(1∶1 000稀釋，Abcam公司)、JAK2一抗(1∶1 000稀釋，Abcam公司)、Bcl2一抗(1∶1 000稀釋，Abcam公司)、Bax一抗(1∶1 000稀釋，Abcam公司)在4℃共同孵育過夜，然后與二抗反應，用增強型化學發光試劑顯影印跡條帶，并用BioRad成像系統檢測，其中條帶信號強度用Quantity One軟件進行定量分析。

1.8 統計學分析

所有數據應用SPSS 20.0軟件進行統計學分析，計量資料以均值±標準差表示，多組間比較采用多因素方差檢驗，兩兩比較采用LSD法進行。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組豚鼠腸道黏膜損傷比較

Sham組豚鼠腸上皮結構完整，未見炎癥細胞浸潤。7 h組豚鼠可見腸上皮結構部分破壞，可見部分腸皮上細胞脫落及小潰瘍形成。14 h組豚鼠腸上皮結構被進一步破壞，可見大量潰瘍及明顯上皮細胞脫落。7 d組及14 d組上皮細胞仍有損傷，但可見炎癥明顯緩解，上皮結構部分恢復。見圖1。

圖1 各組豚鼠腸黏膜病理檢查結果(×400)

2.2 Cajal間質細胞形態的變化

與Sham組相比，在6 h組腸道細胞網絡基本完整；12 h組豚鼠腸道細胞突起的密度和厚度均顯著降低。再灌注7 d、14 d后，腸道細胞網絡部分恢復，且再灌注恢復時間越長，細胞網絡越完整，在第14 d時，細胞網絡已基本恢復正常。見圖2。

圖2 各組Cajal間質細胞形態變化(×200)

2.3 Cajal間質細胞凋亡檢測

TUNEL法檢測腸道細胞凋亡。在Sham組中，沒有檢測到明顯的凋亡細胞。6 h組、12 h組、7 d組、14 d組的凋亡細胞比例分別為(6.84±0.89)%、(48.6±6.85)%、(22.14±4.82)%、(9.64±1.41)%，差異具有統計學意義(P<0.05)。12 h組豚鼠腸道細胞的凋亡細胞比例顯著最高，隨著康復時間的延長，7 d組、14 d組腸道凋亡細胞逐漸下降。見圖3。

圖3 各組腸道細胞TUNEL凋亡檢測(×200)

2.4 各組豚鼠腸組織中炎癥因子水平比較

ELISA檢測結果顯示，12 h組豚鼠腸組織中的炎癥因子，包括TNF-α、乳酸、IL-12、IL-23的表達水平達到峰值，顯著高于其他組豚鼠(P<0.05)。與12 h組相比，7 d組及14 d組豚鼠腸道炎癥因子水平逐漸下降；14 d組豚鼠腸道的IL-12、IL-23的表達水平與Sham組無明顯差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組豚鼠腸組織中炎癥因子水平比較

2.5 Western blot檢測JAK2/STAT2信號通路相關蛋白表達

Western blot檢測顯示，與Sham組相比，6 h組豚鼠腸組織中STAT2、JAK2、Bcl2蛋白表達水平顯著下降(P<0.05)，Bax蛋白水平明顯升高(P<0.05)。12 h組豚鼠腸組織STAT2、JAK2、Bcl2蛋白水平進一步降低(P<0.05)，而7 d組、14 d組豚鼠的STAT2、JAK2、Bcl2蛋白水平逐漸升高，Bax水平下降(P<0.05)。見圖4。

圖4 Western blot檢測JAK2/STAT2信號通路相關蛋白表達

3 討論

近年來，隨著免疫抑制劑和術后處理方案的改進，小腸移植已成為短腸綜合征患者在全腸外營養治療中出現危及生命的并發癥的首選治療方法。然而，缺血再灌注損傷是小腸移植的一個重要限制因素，因為小腸是最易受缺血影響的器官之一。小腸移植物的損傷不僅發生在缺血期間，也發生在再灌注后。小腸的缺血再灌注損傷可引起黏膜水平的顯著改變，黏膜屏障功能受損，進而導致細菌易位和內毒素血癥增加[6]。這可能會促進嚴重的系統性、多器官反應。因此，控制移植物缺血再灌注損傷是小腸移植成功的關鍵。雖然小腸缺血再灌注損傷的詳細機制尚不清楚，但各種介質，如細胞因子(TNF-α和IL-23)、活性氧中間體、血小板活化因子和一氧化氮等，已被證實與內毒素血癥和小腸再灌注損傷有關[7]。在這些介質中，炎癥細胞因子TNF-α和IL-23被認為在炎癥反應的早期階段起著重要作用。本研究通過ELISA檢測發現，12 h組豚鼠腸組織中的炎癥因子，包括TNF-α、乳酸、IL-12、IL-23的表達水平達到峰值。與12 h組相比，7 d組及14 d組豚鼠腸道炎癥因子水平逐漸下降；14 d組豚鼠腸道的IL-12、IL-23的表達水平與Sham組無明顯差異。IL-12在實驗動物中可引起血流動力學休克和組織損傷。最近研究表明，TNF-α和IL-12在肝臟和心臟的缺血再灌注損傷中起重要作用[8]。細胞因子抑制劑FR 167653被證明能抑制脂多糖刺激的人單核細胞產生的TNF-α，并能通過抑制TNF-α的產生來改善內毒素誘導的休克和彌散性血管內凝血[9]。

本研究發現腸缺血再灌注損傷后Kit陽性的Cajal間質細胞凋亡、數量減少，但隨著腸灌注時間的延長，Cajal間質細胞數量明顯恢復。缺血再灌注損傷可導致胃腸功能障礙，如胃腸道轉運延遲，移行運動復合體改變，在體外可導致平滑肌細胞的機械收縮減少[10]。豚鼠腸缺血再灌注損傷模型顯示Kit陽性的Cajal間質細胞的丟失伴隨著自發性機械收縮的減弱，這種收縮可能是由Cajal間質細胞驅動的。因此，有研究者認為Cajal間質細胞在缺血再灌注引起的運動障礙中起核心作用。本研究發現，在腸缺血再灌注豚鼠模型中，ICC-MY中Kit陽性細胞的數量減少了50%，Kit表達丟失可能是運動障礙相關的潛在機制之一。另一些研究者根據Kit信號阻斷實驗，推測Kit的丟失可能導致Cajal間質細胞向平滑肌細胞表型的轉分化[11]。在肝臟、腎臟、心臟以及腸缺血再灌注損傷的動物模型中，細胞凋亡通常存在于組織[12]。本研究采用TUNEL法證實了腸道缺血再灌注造成了腸細胞的凋亡，這可能也是導致腸功能障礙的原因之一。

缺血再灌注損傷可造成線粒體Ca2+超載和活性氧大量釋放，導致線粒體嚴重的結構和功能破壞，是組織細胞缺血再灌注損傷的主要原因[13]。JAK2/STAT2信號通路具有抑制線粒體通透性轉化孔開放、抑制內質網應激反應和促進核因子NF-E2相關因子2激活轉位從而起到抗氧化及抗細胞凋亡等作用，在缺血再灌注損傷中起著重要保護作用[14]。本研究發現與Sham組相比，6 h組豚鼠腸組織中STAT2、JAK2、Bcl2蛋白表達水平顯著下降，Bax蛋白水平明顯升高，而7 d組、14 d組豚鼠的STAT2、JAK2、Bcl2蛋白水平逐漸升高，Bax水平下降(P<0.05)。這表明，缺血再灌注損傷導致的組織細胞凋亡，使Bcl2/Bax蛋白比例失衡，使JAK2/STAT2信號通路活性被抑制。但隨著再灌注時間延長，豚鼠的腸道細胞穩態得到恢復，JAK2/STAT2信號通路活性得到一定程度緩解，這與組織病理學所觀察到的結果一致。

綜上所述，腸缺血再灌注損傷可導致Cajal間質細胞凋亡、數量減少，這可能與抑制JAK2/ STAT3信號通路的活性有關。