紅景天苷保護砷中毒大鼠左心功能：二維斑點追蹤成像觀察

田芮萌，秦文娟，馮 佳，王 臻，翟子敬，蘆桂林

(石河子大學醫學院第一附屬醫院超聲醫學科，新疆 石河子 832008)

砷污染已經成為全球普遍存在的環境問題。自然界中，砷多以三價(As2O3)及五價(NaAsO3)形式存在于水系及土壤內，生物體通過飲水或進食水產品而攝入砷。砷具有顯著心臟毒性，可經氧化應激等多種途徑損害心肌細胞，造成心臟結構及功能損傷[1-2]。紅景天苷具有抗炎、抗腫瘤及調節代謝等功能[3]，其抗氧化作用能有效降低As2O3所致心血管疾病的發病率[4]。二維斑點追蹤成像(two dimensional-speckle tracking echocardiography， 2D-STE)可利用分層應變技術評價左心室不同層次、不同節段應變能力，準確、靈敏地反映左心室功能變化[5-7]。本研究以2D-STE觀察紅景天苷對砷中毒大鼠受損心肌的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 40只8周齡雄性SD大鼠，由新疆醫科大學實驗動物中心提供，體質量180～220 g，于18～26℃、濕度40%～70%條件下飼養，每日12 h光照，自由采食，定量給水。將大鼠隨機分為紅景天苷高劑量組(S30組)、紅景天苷低劑量組(S15組)、模型組、無毒干預組(Sal組)及對照組，每組8只。本研究經院實驗動物倫理委員會批準(批號：A2021-060-01)。

所用試劑及藥物：As2O3(北京雙鷺藥業股份有限公司)；紅景天苷(北京索萊寶科技有限公司，純度99%)；戊巴比妥，肌肉型肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzymes-MB, CK-MB)試劑盒、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase， LDH)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase， SOD)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde， MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 制備模型 于適應性飼養1周后，每日9時以As2O3(5 mg/kg體質量)對S30組、S15組及模型組灌胃，對Sal組及對照組以無菌水灌胃，共30日。之后S30組予紅景天苷30 mg/kg體質量、S15組及Sal組以紅景天苷15 mg/kg體質量，模型組和對照組以無菌水灌胃，持續7日。記錄大鼠一般情況。

1.3 超聲檢查 造模后12 h經腹腔注射2%戊巴比妥溶液麻醉、胸前區備皮后，以左側臥位保定于工作臺上，固定門齒及舌，連接小動物心電圖。以Philips EPIQ 7C型彩色多普勒超聲診斷儀(12S心臟探頭，120～200幀/秒，12 MHz)連續采集>10個心動周期圖像，獲取常規超聲心動圖參數，包括左心室舒張末期內徑(left ventricular end-diastolic diameter， LVEDD)、左心室收縮末期內徑(left ventricular end-systolic diameter， LVESD)、左心室短軸縮短率(left ventricular fraction shortening， LVFS)和左心室射血分數(left ventricular ejection fraction， LVEF)。采用2D-STE于乳頭肌短軸平面獲取左室中間段心內膜下/中層/心外膜下心肌整體圓周應變(global circumferential strain in subendocardial myocardium/middle myocardium/subepicardial myocardium， GCS-Endo/Mid/Epi)和心內膜下層心肌各節段圓周應變(circumferential strain， CS)，包括左心室中間段前壁/前間隔/后間隔/后壁/下壁/側壁(anterior/antero-septum/inferd-septum/infero-lateral/inferlor/antero-lateral of mid-cavity segments， MA/MAS/MIS/MIL/MI/MAL)。測量3次，取平均值。

1.4 實驗室及病理檢查 經內眥靜脈采血3 ml，檢測血清CK-MB和LDH。之后處死動物，摘取其心臟并稱重，計算心臟系數(心臟系數=心臟質量/體質量×100%)，檢測心肌組織SOD、MDA，均重復檢測3次，取平均值；行HE染色，并于光鏡下觀察。

1.5 統計學分析 采用SPSS 22.0統計分析軟件。以±s表示符合正態分布且方差齊的計量資料。采用單因素方差分析行多組間比較，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以Pearson相關性分析評價分層應變參數與心肌標志物之間的相關性。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

各組大鼠初始體質量差異無統計學意義 (P>0.05)。造模后S30組、S15組和模型組大鼠精神欠佳，反應遲鈍，采食、飲水減少，毛色暗淡；Sal組與對照組大鼠精神狀況較好，反應迅速，采食、飲水正常，毛發光澤，體質量增加；模型組末次體質量小于對照組(P<0.05)。各組大鼠心臟質量差異均無統計學意義 (P均>0.05)。

模型組與S30組、S15組及對照組心臟系數差異均有統計學意義(P均<0.05)，見表1。S30組、S15組及模型組心肌細胞不同程度排列紊亂，細胞腫脹，細胞核濃縮、深染，胞漿染色加深，細胞間隙增寬，可見壞死灶及紅細胞滲出，尤以模型組最著而S15組次之(圖1)；Sal組及對照組心肌細胞排列整齊，形態正常，結構完整，細胞核居中，細胞間隙均勻。

表1 大鼠體質量、心臟質量變化情況

圖1 大鼠心肌組織病理圖(HE，×100) A.S30組； B.S15組； C.模型組； D.Sal組； E.對照組

2.1 實驗室指標 S30組、S15組及模型組CK-MB、LDH及MDA水平均高于、SOD水平均低于對照組(P均<0.05)，兩兩比較差異均有統計學意義 (P均<0.05)；Sal組與對照組各指標差異均無統計學意義(P均>0.05)，見表2。

表2 各組大鼠實驗室指標比較

2.2 超聲參數 S30組、S15組及模型組LVFS、LVEF均較對照組減低(P均<0.05)，且S30組及S15組明顯高于模型組(P均<0.05)；S30組與S15組、 Sal組與對照組LVFS、LVEF差異均無統計學意義(P均>0.05)。各組間LVEDD、LVESD差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表3。

S30組、S15組及模型組GCS-Endo、GCS-Mid和GCS-Epi均較對照組減低(P均<0.05)，且組間GCS-Endo兩兩比較差異均有統計學意義(P均<0.05)；Sal組與對照組差異無統計學意義(P均>0.05)。S30組、S15組及模型組各節段應變參數均較對照組減低(P均<0.05)，S30組和S15組CS-MA、CS-MAS、CS-MIS、CS-MIL及CS-MI均高于模型組(P均<0.05)，S30組CS-MA、CS-MIL和CS-MI均高于S15組(P均<0.05)；Sal組與對照組各節段應變參數差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表3及圖2～4。

表3 各組大鼠超聲參數比較

圖2 大鼠GCS-Endo及各節段CS A.S30組； B.S15組； C.模型組； D.Sal組； E.對照組

2.3 相關性 GCS-Endo、GCS-Mid、GCS-Epi與CK-MB(r=-0.926、-0.813、-0.738，P均<0.05)和LDH(r=-0.908、-0.803、-0.737，P均<0.05)均呈負相關。

3 討論

血清CK-MB、LDH水平可反映心肌受損程度[8]，心肌組織SOD、MDA含量代表其過氧化及抗過氧化水平[9]，由此可觀察砷中毒后心肌損傷及恢復情況[10]。本研究以As2O3對大鼠灌胃，構建砷中毒大鼠模型，發現模型鼠活動逐漸遲緩，毛發稀疏，精神欠佳，S30組、S15組和模型組較對照組CK-MB、LDH及MDA上升、SOD下降，LVEF、LVFS降低，且病理見心肌細胞受損表現，表明砷中毒可致大鼠心肌細胞結構及功能受損；予紅景天苷灌胃后S30組、S15組大鼠一般情況好轉，CK-MB、LDH及MDA下降而SOD上升，心肌細胞病理形態有所好轉，LVFS和LVEF也有所升高，而S30組與S15組間并無明顯差異，提示紅景天苷可在一定程度上促進砷中毒大鼠心肌細胞和心臟結構功能恢復；但常規超聲心動圖敏感度欠佳，且受心率、檢測角度等因素影響較大，無法用于評估紅景天苷劑量與心肌功能恢復程度的關系[5]。

2D-STE可標記并追蹤心內膜位移，利用后處理技術直接觀察各層心肌不同節段的應變能力，更加精確、直接地反映左心室功能[6]。本研究2D-STE結果顯示，砷中毒大鼠心肌應變能力低于正常大鼠，且模型組改變較S30組及S15組更為明顯，與常規超聲心動圖所見相符。砷對大鼠各層心肌的毒害作用有所不同[11-12]。本研究發現砷中毒后大鼠GCS-Endo下降最為明顯，而予紅景天苷后GCS-Endo恢復也最快，且相關性分析提示各層心肌GCS與CK-MB、LDH均呈負相關，尤以GCS-Endo相關性最高，提示心內膜下心肌細胞對砷和紅景天苷均更為敏感，可能原因在于砷進入循環系統后最先累及由冠狀動脈終末支供血的內層心肌細胞[13]。

圖3 大鼠GCS-Mid及各節段CS A.S30組； B.S15組； C.模型組； D.Sal組； E.對照組

本研究中，砷中毒大鼠心肌所有節段CS均較對照組降低；予紅景天苷后，除MAL外，各節段 CS均較模型組增高，且S30組MA、MIL及MI的CS均高于S15組，提示砷中毒可損傷左心室各節段心肌，而紅景天苷有助于大部分節段恢復，且藥物劑量對各節段心肌細胞產生的效果可能不同，原因可能在于不同節段心肌細胞對紅景天苷的敏感度不同。本研究Sal組與對照組間超聲應變參數、生化指標及心肌病理形態學表現均無顯著差異，提示對正常個體短期使用紅景天苷不會對心臟結構及功能產生顯著影響，即無明顯心臟毒副作用。

綜上，2D-STE可早期發現砷中毒大鼠左心室功能變化，評估心肌受損及使用紅景天苷后恢復情況，具有較高敏感度。本研究的主要局限性：①行超聲心動圖檢查時，因切面受限，未能與縱向應變參數進行對比；②僅設置2組不同劑量紅景天苷，觀察劑量依賴性的價值有限，有待進一步觀察。