腦脊液外泌體lncRNA SOCS2-AS1預測腦膠質瘤復發的價值

劉玉川 崔彥魁 程 鵬

膠質瘤是顱內常見腫瘤之一，術后易復發。研究顯示，復發性腦膠質瘤的中位生存時間在3～6 個月[1]。外泌體是一種直徑在40～100 nm的盤狀囊泡，存在于血液、腦脊液、尿液和唾液等體液中[2]，參與細胞信號轉導并影響腫瘤細胞惡性生物學特征[2，3]。相比于體液長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA），外泌體lncRNA 更易檢測，也更準確反映腫瘤細胞真實lncRNA的表達水平[4]。細胞因子信號轉導抑制因子2-反義轉錄本1（suppressor of cytokine signaling 2-antisense transcript 1，SOCS2-AS1）是新發現的lncRNA，影響腫瘤細胞凋亡、侵襲、遷移等[5～7]。本文探討腦脊液外泌體lncRNA SOCS2-AS1預測腦膠質瘤術后復發的價值。

1 資料與方法

1.1 病例選擇標準 納入標準：組織病理學檢測證實為腦膠質瘤；術后完成2～4個療程放療、化療或同步放化療；病例資料完整。排除標準：合并其他部位腫瘤；合并其他腦部疾病；既往有腦部手術史；合并嚴重心肝腎疾病；存在急慢性感染；合并免疫性疾病。

1.2 一般資料2017年1月至2018年1月收治符合標準的腦膠質瘤84例，其中男49例，女35例；年齡35～79歲，平均（49.30±10.02）歲；高級別膠質瘤46例，低級別膠質瘤38例。選取將康體檢者30例為對照，其中男18 例，女12 例；年齡28～54 歲，平均（48.23±8.23）歲。本研究經我院倫理委員會批準，病人均簽署知情同意書。

1.3 外泌體的分離和鑒定 腰椎穿刺術取腦脊液1.5 ml。1 500 轉/min 離心15 min，留取上清液。用外泌體分離試劑盒（上海源葉生物科技有限公司）分離外泌體，操作步驟按照試劑盒說明書進行。

取10 μl外泌體懸液滴加于銅網上沉淀60 s，用濾紙吸取懸液。取醋酸雙氧鈾10 μl 滴加于銅網上沉淀60 s，吸干液體。在常溫下干燥10 min，用Tecnai Spirit G2 透射電子顯微鏡觀察外泌體形態。采用英國NanoSight 納米顆粒分析儀檢測外泌體粒徑分布及濃度。采用免疫印跡法檢測外泌體表面標志蛋白CD63 和TSG101[8]，步驟如下：取100 μl 外泌體，加入RIPA 細胞裂解液，提取蛋白；進行SDSPAGE 凝膠電泳分離蛋白并電轉至PVDF 膜上；用5%脫脂牛奶封閉，加入兔抗人CD63 單克隆抗體（1:1 000，美國Sigma 公司）或兔抗人TSG101 單克隆抗體（1:500，美國Sigma公司），4 ℃孵育過夜。TBST洗滌3次，加入羊抗兔二抗，溫室孵育1 h，再用TBST洗滌3次。最后用ECL顯影。

1.4 RT-PCR檢測腦脊液外泌體lncRNA SOCS2-AS1的表達水平 用外泌體RNA 提取試劑盒（武漢艾美捷科技有限公司）提取外泌體總RNA。用Prime-Script RT試劑盒（武漢艾美捷科技有限公司）進行逆轉錄，獲得cDNA。隨后用SYBR Green試劑盒（上海聯邁生物工程有限公司）對cDNA 進行擴增。反應條件：94 ℃、10 min，94 ℃、45 s；60 ℃、45 s；72 ℃、45 s；共 計40 個 循 環。SOCS2-AS1 上 游 引 物5′-AAAGCAAGGTCTCCCCACAAG-3′，下 游 引 物5′-GGTCTGTGCTAGATCAAAAGGCA-3′；內參GAPDH上游引物5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游引物5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。用2-ΔΔCt計算相對表達量。以lncRNA SOCS2-AS1 相對表達量中位數為截斷值，將膠質瘤分為高表達組和低表達組。

1.5 隨訪 術后門診或電話隨訪，隨訪時間1～36 個月。復發定義為：腫瘤生長范圍較術前擴大或者腫瘤出現在不同部位[9]。

1.6 統計學方法 采用SPSS 20.0進行分析；計量資料用±s表示，用t檢驗；計數資料用χ2檢驗；采用多因素logistic 回歸模型分析腦膠質瘤復發的影響因素；采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析腦脊液外泌體lncRNA SOCS2-AS1 水平預測腦膠質瘤復發的價值，計算曲線下面積（area under the curve，AUC）、靈敏度和特異度；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腦脊液外泌體鑒定結果 透射電子顯微鏡觀察顯示，腦脊液外泌體直徑約100 nm（圖1A）；免疫印跡法檢測結果顯示膠質瘤組及對照組腦脊液外泌體均表達CD63 和TSG101 蛋白（圖1B）；Nanosight 檢測發現，外泌體直徑平均138.2 nm，濃度平均為2.30×1011個顆粒/ml（圖1C）。

圖1 腦脊液外泌體鑒定結果

2.2 膠質瘤病人腦脊液外泌體lncRNA SOCS2-AS1的表達水平 膠質瘤組腦脊液外泌體lncRNA SOCS2-AS1 相對表達量[（1.45±0.25）]明顯高于對照組[（0.56±0.12），P＜0.001]。高級別膠質瘤腦脊液外泌體lncRNA SOCS2-AS1 相對表達量為[（1.87±0.51）]明顯高于低級別膠質瘤[（1.04±0.28），P＜0.001]。

2.3 腦膠質瘤術后復發的影響因素 單因素分析顯示，腫瘤直徑、腫瘤分級、腫瘤切除程度、腦脊液外泌體lncRNA SOCS2-AS1 表達水平與腦膠質瘤術后復發有關（P＜0.05，表1）。多因素logistic 回歸分析顯示，腫瘤直徑≥5 cm、高級別膠質瘤、腫瘤未全切除、腦脊液外泌體lncRNA SOCS2-AS1 高表達是術后復發的獨立影響因素（P＜0.05，表1）。

表1 腦膠質瘤術后復發危險因素的logistic回歸分析

2.4 腦脊液外泌體lncRNA SOCS2-AS1 水平預測腦膠質瘤術后復發的價值ROC曲線分析顯示，腦脊液外泌體lncRNA SOCS2-AS1 高表達預測腦膠質瘤術后復發的AUC 為0.917，靈敏度為85.78%，特異度為93.10%。見圖2。

圖2 ROC曲線分析腦脊液外泌體lncRNA SOCS2-AS1水平預測腦膠質瘤術后復發的價值

3 討論

膠質瘤通常呈侵襲性生長，邊界不清楚，手術不易完全切除，因此術后容易復發[10]。外泌體是一種內源性囊泡，能夠運輸脂質、核苷酸、非編碼RNA及蛋白質等[3]。腫瘤細胞可以通過外泌體將活性分子傳遞給受體細胞，影響受體細胞功能；另外，外泌體運載的活性分子可以與腫瘤微環境中巨噬細胞相互作用，加速腫瘤進展[11]。lncRNA 在表觀遺傳、轉錄及轉錄后水平影響基因表達，與腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移和凋亡等密切相關。外泌體源性lncRNA參與腦膠質瘤的發生、發展，在腦膠質瘤診斷、治療和預 后 評 估 中 發 揮 重 要 作 用[4，12，13]。lncRNA SOCS2-AS1 是近年來新發現的lncRNA，在轉錄水平起調節作用，影響腫瘤進展[5～7]。有研究發現，lncRNA SOCS2-AS1在前列腺癌組織[5]、腦膠質瘤組織[14]中高表達，并且與病人不良生存預后有關。本文發現，腦膠質瘤病人腦脊液外泌體lncRNA SOCS2-AS1 表達水平升高，并且高級別膠質瘤的表達水平明顯高于低級別膠質瘤，提示lncRNA SOCS2-AS1 可能參與腦膠質瘤發生、發展。

影響腦膠質瘤術后復發的因素較多。本文發現腫瘤直徑、腫瘤分級、腫瘤切除范圍是腦膠質瘤術后復發的影響因素，與既往報道一致[8，15，16]。腫瘤侵襲性增長是膠質瘤術后復發的重要影響因素。lncRNA SOCS2-AS1 可 通 過miR-1264 信 號 通 路[7]、ITGB1 信號通路[14]等促進腫瘤細胞侵襲。本文單因素logistic 回歸分析和ROC 曲線分析顯示lncRNA SOCS2-AS1 與腦膠質瘤術后復發的關系，結果顯示lncRNA SOCS2-AS1 高表達是腦膠質瘤術后復發的獨立影響因素，并且有較高的預測價值，靈敏度為85.78%，特異度為93.10%。

總之，腦膠質瘤病人腦脊液外泌體lncRNA SOCS2-AS1 表達水平升高，腦脊液外泌體lncRNA SOCS2-AS1高表達對腦膠質瘤術后復發有較高的的預測價值。