人腦膜瘤組織Slit2、Robo1的表達與術后復發的關系

羅顯華 張淳化 羅長穩 李銘輝

腦膜瘤是顱內常見的腫瘤，多為良性，手術切除治療效果良好，但是部分腦膜瘤具有侵襲性，術后易復發，預后往往較差[1]。神經生長導向因子Slit 及其細胞膜受體Roundabout（Robo）屬于分泌蛋白家族，其成員包括Slit1、Slit2、Slit3、Robo1、Robo2、Robo3、Robo4。Slit2/Robo1 信號通路在神經元遷移及軸突生長中起重要作用[2]。研究發現，Slit2/Robo1信號通路具有調節白細胞趨化的作用[3]，還可以通過影響腫瘤微環境來影響腫瘤細胞的增殖遷移，進而參與膠質瘤等腫瘤的發生發展[4]。本文探討人腦膜瘤組織Slit2、Robo1 的表達與術后復發的關系，為臨床提供參考。

1 資料與方法

1.1 標本來源 納入標準：病理檢查證實為腦膜瘤；病例資料完整。排除標準：合并其他部位腫瘤；合并嚴重心肝腎等臟器功能障礙；復發性腦膜瘤；有顱腦損傷病史。選取2016年1月至2021年4月手術切除的腦膜瘤組織104 例，其中男61 例，女43 例；年齡56～71 歲，平均（57.01±10.12）歲；腫瘤直徑2～8 cm，平均（4.58±1.87）cm；腫瘤位于大腦凸面51 例、大腦鐮和矢狀竇旁30例、其他23例；侵襲性腦膜瘤46例（指向鄰近腦組織、硬腦膜、靜脈竇、顱骨等浸潤生長[5]）；瘤周圍重度水腫48例（瘤周水腫指數＞3[6]）；癲癇39例，顱內壓升高12例，視力下降30例，肢體運動障礙8例。另選取顱腦損傷內減壓術切除的非腫瘤腦組織50例（對照組），其中男29例，女21例；年齡53～68 歲，平均（55.90±5.76）歲。本研究經過醫院倫理委員會批準。

1.2 檢測方法 用免疫組織化學染色法檢測Slit2 和Robo1的表達水平。10%中性福爾馬林（上海遠慕生物科技有限公司）固定，隨后梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋切片（厚度4 μm）。用二甲苯脫蠟，乙醇水化，檸檬酸鈉抗原修復液（上海語純生物科技有限公司）進行抗原修復，隨后用羊血清封閉。按照免疫組化SP法檢測試劑盒（上海遠慕生物科技有限公司）操作。一抗兔抗人Slit2單克隆抗體（1:500，美國Sigma公司）或兔抗人Robo1單克隆抗體（1:1 000，美國Sigma）4 ℃孵育過夜。二抗酶標羊抗兔抗體（美國Sigma公司）室溫孵育1 h，DAB顯色，蘇木精復染，顯微鏡下觀察。染色為棕黃色顆粒視為表達陽性（圖1）。隨機選擇10個高倍（400倍）視野，每個視野隨機選100 個細胞，進行染色評分。染色強度的評分方法：未著色0 分，淺黃色1 分，棕黃色2 分，棕褐色3 分。陽性細胞比例評分：≤5%為0 分，6%～25%為1 分，26%～50%為2 分，51%～75%為3 分，＞75%為4分。將染色強度評分和陽性細胞比例評分相乘，≥4分為高表達[7]。

1.3 術后隨訪 術后3、6、9、12個月復查MRI，判斷是否復發。復發定義為原已消失或緩解的臨床癥狀、體征又出現，影像學檢查或再次手術發現原手術部位腦膜瘤再次生長[8]。

1.4 統計學方法 采用SPSS 20.0軟件分析；計量資料用±s表示，用t檢驗；計數資料采用χ2檢驗；用多因素logistic 回歸模型分析腦膜瘤術后復發的影響因素；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 術后復發率104例中，術后1年內復發22例，復發率為21.15%。

2.2 腦膜瘤組織Slit2、Robo1 的表達水平 腦膜瘤組織Slit2 低表達率[37.50%（39/104）]明顯低于對照組[70.00%（35/50）；P＜0.05]。腦膜瘤組織Robo1高表達率[59.61%（62/104）]明顯高于對照組[34.00%（17/50）；P＜0.05]。

2.3 腦膜瘤術后復發的影響因素 單因素分析發現，腫瘤直徑、侵襲性生長、瘤周水腫、WHO 分級、腫瘤切除程度、Slit2 和Robo1 表達水平是腦膜瘤術后復發的影響因素（P＜0.05，表1）。多因素logsitic回歸分析顯示，腫瘤直徑≥5 cm、侵襲性生長、重度瘤周水腫、WHO分級Ⅲ級、腫瘤未全切除、Slit2低表達、Robo1 高表達是腦膜瘤術后復發的獨立危險因素（P＜0.05，表2）。

表1 本文104例腦膜瘤術后復發危險因素的單因素分析

表2 本文104例腦膜瘤術后復發危險因素的多因素logistic回歸分析

3 討論

Slit2 基因定位于染色體4p15.2，其蛋白可以由神經膠質細胞合成，屬于分泌性糖蛋白。Slit2 具有調節軸突導向及神經元遷移的作用，并且影響血管內皮細胞增殖及包細胞趨化[9]。Slit2 表達異常與中樞神經系統疾病有關，如膠質瘤和阿爾茨海默病[10]。近年來研究發現，Slit2可以刺激其受體Robo1表達，誘導血管生成，進而影響腫瘤生長[11]。研究證實，Slit2/Robo1 信號通路可通過影響腫瘤細胞的增殖、分化、遷移、免疫反應，參與白血病[12]、結直腸癌[13]、宮頸癌[14]等發生發展。有研究發現腦膠質瘤Slit2表達水平較低，而Robo1表達水平較高，并且Slit2和Robo1 是影響膠質瘤生存預后的影響因素[15]。本文發現，Slit2 及Robo1 陽性主要定位于細胞核和細胞質，腦膜瘤組織Slit2 表達降低，而Robo1 表達增高，提示Slit2/Robo1信號通路可能參與腦膜瘤的發生。

腦膜瘤術后復發受多種因素影響，文獻報道腦膜瘤術后1 年復發率可達19%[16]。本文104 例腦膜瘤，術后1年復發率為21.15%。有研究發現，腦膜瘤術后復發的影響因素包括，腫瘤大小、侵襲性生長、瘤周水腫、WHO分級、腫瘤切除程度[17～19]。本文結果與此相符。另外，本文發現，Slit2低表達和Robo1過表達是腦膜瘤術后復發的獨立危險因素。這可能是Slit2/Robo1 信號通路降低細胞間的粘附能力，使腫瘤細胞生長，導致增殖和侵襲的發生，增加復發風險[13]。另外，Slit2/Robo1信號通路導致細胞運動能力受到影響，損傷細胞外基質，增強腫瘤細胞抗凋亡作用[20]。此外，Slit2/Robo1信號通路介導的免疫炎癥損傷也是腦膜瘤術后復發的重要原因之一[21]。

總之，腦膜瘤組織Slit2表達水平降低，而Robo1表達水平升高，Slit2 低表達和Robo1 高表達是腦膜瘤術后復發的獨立影響因素。這提示Slit2/Robo1信號通路可能參與腦膜瘤進展。