抑制SSRP1對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、化療敏感性的影響

陶 祥 張文斐 冀保衛(wèi) 張 戈 陳治標(biāo)

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見(jiàn)的原發(fā)性惡性腫瘤。近些年，隨著神經(jīng)外科顯微技術(shù)、放化療技術(shù)等進(jìn)展，膠質(zhì)瘤的治療取得一定的進(jìn)步，但其病死率仍居高不下。膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性增殖、對(duì)放化療的抵抗性、復(fù)發(fā)是導(dǎo)致病人最終死亡的重要原因。膠質(zhì)瘤發(fā)生和進(jìn)展的分子機(jī)制非常復(fù)雜，探索其分子機(jī)制對(duì)開(kāi)發(fā)新的治療策略非常重要。結(jié)構(gòu)特異性識(shí)別蛋1（structure specific recognition protein 1，SSRP1）是促進(jìn)染色質(zhì)轉(zhuǎn)錄復(fù)合體形成的亞基。研究表明SSRP1主要通過(guò)調(diào)控核小體的合成與降解，參與DNA損傷修復(fù)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞凋亡和周期調(diào)控[1，2]。SSRP1表達(dá)上調(diào)與多種腫瘤的不良臨床病理特征和惡性預(yù)后相關(guān)，如結(jié)直腸癌[3，4]、膀胱癌[5]、肝細(xì)胞癌[6～8]、胃癌[9]、惡性黑色素瘤[10]。然而，SSRP1 在膠質(zhì)瘤中的臨床病理學(xué)意義和生物功能作用尚不清楚。絲裂原激活的蛋白激酶（mitogen- activated protein kinase,MAPK）信號(hào)通路在膠質(zhì)瘤中常常為過(guò)度激活狀態(tài)[11]，與膠質(zhì)瘤不良預(yù)后有關(guān)[12]。本文探討SSRP1與膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、化療敏感性的關(guān)系，及MAPK信號(hào)在其中的作用。

1 材料和方法

1.1 生信分析 膠質(zhì)瘤臨床資料下載自中國(guó)腦膠質(zhì)瘤基因組計(jì)劃CGGA（http://cgga.org.cn/），包括全外顯子序列數(shù)據(jù)集WEseq_286，mRNA 數(shù)據(jù)集mRNAseq_325、mRNAseq_693 和mRNA_array_301（以上原始數(shù)據(jù)均可在http://cgga.org.cn/download.jsp 下載）。數(shù)據(jù)集中包含有性別、年齡、WHO 級(jí)別及組織學(xué)分型、總體生存期（overall survival，OS）、是否放療、是否化療、IDH突變情況、1p/19q是否有聯(lián)合缺失以及相應(yīng)的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251、U87細(xì)胞[中國(guó)科學(xué)院（上海）細(xì)胞庫(kù)]培養(yǎng)于含10%胎牛血清（杭州四季青生物材料研究所）的DMEM 培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco 公司）培養(yǎng)，每3 天一次以含EDTA 的0.25%胰酶消化，1：3傳代。

1.3 細(xì)胞分組 將U251、U87 細(xì)胞接種96 孔板，每孔100 μl（含1×105個(gè)細(xì)胞），分為SSRP1 抑制劑組和對(duì)照組。SSRP1 抑制劑組加入終濃度為600 nmol/L 的CBL0137（上海東蒼生物公司），對(duì)照組加入等體積PBS。檢測(cè)化療敏感性時(shí)，SSRP1 抑制劑組在CBL0137 作用基礎(chǔ)上，加入替莫唑胺（temozolomide，TMZ；上海瀚香生物科技有限公司），濃度分別為30、60、90、120、150 μmol/L；對(duì)照組加入等體積PBS。

1.4 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96 孔板培養(yǎng)24、48、72 h，按CCK8 試劑盒（日本Dojindo 公司）說(shuō)明書操作，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 處吸光度。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.5 免疫印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá) 使用添加蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)蛋白濃度。40 μg/孔上樣后行常規(guī)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。濕法轉(zhuǎn)移蛋白到PVDF 膜上，5%胎牛血清溶液室溫封閉2 h，加入一抗（1:800）4 ℃孵育過(guò)夜，加入二抗（1:5 000）室溫孵育1 h，ECL發(fā)光液孵育后顯影和定影。抗SSRP1 抗體購(gòu)自英國(guó)Cambridge 公司，抗GAPDH、p-p-38、p-ERK、p-JNK、p-38、ERK、JNK 抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology 公司，抗鼠或抗兔HRP 標(biāo)記的二抗購(gòu)自美國(guó)Promega Biotechnology公司。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 19.0軟件分析；計(jì)量資料用±s表示，使用t檢驗(yàn)；P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 生信分析結(jié)果WEseq_286 分析結(jié)果顯示，286例膠質(zhì)瘤基因組外顯子序列中，283 例為野生型，3例為突變型（1%，3/286；圖1A）。mRNAseq_325 和mRNA_array_301 分析顯示，WHO 分級(jí)Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤SSRP1 表達(dá)水平較WHO 分級(jí)Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤明顯上調(diào)（P＜0.05；圖1B、1C）。

圖1 膠質(zhì)瘤組織SSRP1表達(dá)

mRNAseq_325、mRNAseq_693 分析顯示1p/19q聯(lián)合缺失型低級(jí)別膠質(zhì)瘤（low grade glioma，LGG）的SSRP1 表達(dá)明顯下調(diào)，IDH 野生型LGG 的SSRP1 表達(dá)明顯下調(diào)；IDH 野生型膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma,GBM）的SSRP1表達(dá)明顯下調(diào)（圖2 A、2B）；與原發(fā)性膠質(zhì)瘤相比，復(fù)發(fā)性膠質(zhì)瘤SSRP1 表達(dá)顯著上調(diào)（圖2C、2D）。Kaplan-Meier 生存曲線分析顯示，SSRP1 低表達(dá)組病人OS明顯優(yōu)于高表達(dá)組（圖3）。

圖2 膠質(zhì)瘤SSRP1表達(dá)與IDH突變、1p/19q缺失以及腫瘤復(fù)發(fā)的關(guān)系

圖3 膠質(zhì)瘤SSRP1表達(dá)與病人預(yù)后的關(guān)系

2.2 抑制SSRP1抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251及U87細(xì)胞增殖 與對(duì)照組相比，SSRP1 抑制劑組U251、U87 細(xì)胞增殖受到顯著抑制（P＜0.05；圖4）。

圖4 抑制SSRP1抑制膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞、U87細(xì)胞增殖

2.3 抑制SSRP1 增加U251 及U87 細(xì)胞對(duì)TMZ 的化療敏感性 隨TMZ 濃度增高，U251、U87 細(xì)胞增殖能力明顯降低（P＜0.05）；與對(duì)照組相比，SSRP1抑制劑組U251、U87細(xì)胞增殖能力明顯降低（P＜0.05；圖5）。

圖5 抑制SSRP1增強(qiáng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞、U87細(xì)胞對(duì)TMZ的化療敏感性

2.4 抑制SSRP1 抑制U251、U8 細(xì)胞MAPK 信號(hào)通路與對(duì)照組相比，SSRP1組MAPK信號(hào)通路p-38、ERK及JNK 蛋白水平無(wú)明顯改變（P＞0.05；圖6），但磷酸化水平顯著下降（P＜0.05；圖6）。

圖6 抑制SSRP1抑制膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞、U87細(xì)胞MAPK信號(hào)通路

3 討論

我們的研究表明SSRP1 與膠質(zhì)瘤WHO 級(jí)別、IDH 突變、1p/19q 聯(lián)合缺失、腫瘤復(fù)發(fā)和OS 相關(guān)。顯微手術(shù)切除聯(lián)合放化療仍是膠質(zhì)瘤的重要治療方法，如何克服腫瘤細(xì)胞的放化療抗性是重要的研究方向。CBL0137 最初用于調(diào)控P53 及NF-κB，嘗試解決腫瘤細(xì)胞的化療抵抗性，然而后來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)CBL0137可特異性抑制FACT，在多種惡性腫瘤中具有明顯抗腫瘤作用，如腎細(xì)胞癌、黑色素瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤和小細(xì)胞肺癌。據(jù)報(bào)道，CBL0137 可促進(jìn)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞失活及凋亡[13]，還可通過(guò)激活Notch1 抑制小細(xì)胞肺癌中干細(xì)胞樣細(xì)胞與順鉑產(chǎn)生協(xié)同作用[14]，增強(qiáng)肺癌化療敏感性[15]。我們的研究表明CBL0137 可顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)TMZ 的化療敏感性，其機(jī)制可能與抑制SSRP1 進(jìn)而抑制MAPK 信號(hào)通路有關(guān)。MAPK 信號(hào)通路與膠質(zhì)瘤的相關(guān)研究報(bào)道較多。lncRNA MATN1-AS1 調(diào)控MAPK 信號(hào)通路，抑制GBM 細(xì)胞增殖和侵襲[16]。環(huán)狀RNA MAPK4 調(diào)控miR-125a-3p，抑制MAPK 信號(hào)通路介導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡[17]。GBM的ZDHHC17基因顯著上調(diào)，激活MAPK信號(hào)通路的重要組成部分p38/JNK，導(dǎo)致GBM 惡性進(jìn)展[18]。lncRNA SNHG5 通 過(guò)p38 信 號(hào) 通 路 促 進(jìn)GBM 細(xì)胞增殖[19]。洋椿苦素可負(fù)調(diào)節(jié)MAPK 信號(hào)通路，抑制耐TMZ 膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、微血管生成及細(xì)胞周期紊亂，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[20]。

總之，膠質(zhì)瘤SSRP1呈高表達(dá)，與病人不良預(yù)后有關(guān)。抑制SSRP1，可通過(guò)抑制MAPK信號(hào)通路，抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)TMZ 的化療敏感性。