肉桂醛對神經(jīng)膠質瘤U251細胞生物學行為的影響

白敬洋 桂志勇 葉黨華

膠質瘤是顱內最常見的原發(fā)性惡性腫瘤[1，2]，近年來在臨床治療方面雖然取得了一定的進展，但預后仍不理想[1]。肉桂醛是肉桂揮發(fā)油的主要成分，具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤等作用[2～5]。本文探索肉桂醛對膠質瘤細胞增殖、侵襲、遷移和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人神經(jīng)膠質瘤細胞系U251 購自中國上海科學院生物化學與細胞生物學研究所；肉桂醛（純度98%）購自上海純優(yōu)生物科技有限公司；CCK-8試劑盒、超敏ECL化學發(fā)光試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司；結晶紫染色試劑盒購自上海哈靈生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒購自美國Sigma-Aldrich 公司；小鼠抗人p-PI3K、PI3K、p- Akt、Akt、C- Myc、cycling- D、βcatenin、Cleaved-Caspase-3、Bcl-2、Bax 抗體購自美國Cell Signaling Technology 公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)與分組 將人神經(jīng)膠質瘤細胞系U251置于含10%胎牛血清的DMEM中培養(yǎng)，分為對照組、低劑量肉桂醛組和高劑量肉桂醛組。肉桂醛組分別加入40 μmol/L、80 μmol/L 肉桂醛，而對照組加入等體積肉桂醛溶劑二甲基亞砜。

1.3 平板克隆形成實驗 將U251 細胞懸液接種于含10%胎牛血清的細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周；PBS清洗細胞3次，甲醇固定并用結晶紫染色，拍照并分析。

1.4 CCK-8 檢測細胞增殖能力 將U251 細胞按104個/孔接種到96 孔板培養(yǎng)24 h、36 h、48 h、72 h，根據(jù)試劑盒說明書每孔加入10 μl CCK-8 試劑孵育2 h，酶標儀檢測450 nm波長處吸光度值。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡 收集細胞，使用預冷PBS 輕柔沖洗，并用200 μl 結合緩沖液重懸細胞。按照Annexin-v-FITC/PI 試劑盒說明操作，分別加入Annexin V-FITC 與PI 試劑在避光條件下染色15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.6 Transwell 小室實驗 將U251 細胞接種于有Matrigel基質的上室，加入不含胎牛血清的200 μl培養(yǎng)液；下室加入含10%胎牛血清培養(yǎng)液500 μl。培養(yǎng)1 d 后，用棉簽除去上室膜上未遷移的細胞，而通過基質膜完成侵襲的細胞用甲醇固定，并用0.1%結晶紫溶液染色，對侵襲細胞進行檢查和計數(shù)。

1.7 細胞劃痕實驗 在6 孔板底部用marker 筆畫出2條橫線，間隔為5 mm，然后將U251 細胞接種于6 孔板培養(yǎng)，每孔加入2 ml 含10%胎牛血清的細胞培養(yǎng)基。待細胞密度達80%后，用200 μl 吸管尖沿6 孔板底部橫線垂直刮擦細胞培養(yǎng)板。用PBS沖洗每孔細胞3 次，然后丟棄清洗液，以除去未貼壁的細胞，加入含有不同濃度肉桂醛的新培養(yǎng)基。倒置顯微鏡拍照記錄各組在不同時間點（0 h、36 h）的劃痕面積，利用Image J軟件計算劃痕距離變化。

1.8 免疫印跡法檢測蛋白表達 提取細胞總蛋白，測定蛋白質濃度，SDS-PAGE電泳分離蛋白，并轉移到PVDF膜上；用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1 h，加入一抗[Bcl-2（1:1 000）、Cleaved-Caspase-3（1:500）、Bax（1:500）、p-PI3K（1:300）、PI3K（1:300）、p-Akt（1:300）、Akt（1:300）、C-Myc（1:400）、cycling-D（1:500）、β-catenin（1:500）和β-actin（1:500）]4 ℃孵育過夜；用辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG（1:2 000）室溫孵育1.5 h；使用超敏ECL 化學發(fā)光試劑盒作用后，Image J軟件進行蛋白質定量分析。

1.9 統(tǒng)計學分析 使用Graphpaid 8.0 軟件分析；計量資料以±s表示，采用單因素方差分析和Tukey 檢驗；P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 肉桂醛抑制U251 細胞增殖 與對照組比較，肉桂醛組細胞集落形成能力、細胞增殖能力明顯下降（P＜0.01）；而且，隨劑量增大，肉桂醛抑制細胞增殖作用顯著增強（P＜0.01）。見圖1。

圖1 肉桂醛對膠質瘤U251細胞增殖的影響

2.2 肉桂醛促進膠質瘤細胞凋亡 與對照組相比，肉桂醛組細胞凋亡率顯著增加（P＜0.05），抗凋亡蛋白Bcl-2 表達顯著降低（P＜0.05），促凋亡蛋白Bax 和Cleaved caspase-3 表達顯著增加（P＜0.05）；而且，隨劑量增大，肉桂醛抑制細胞凋亡作用顯著增強（P＜0.05）。見圖2。

圖2 肉桂醛對膠質瘤U251細胞凋亡的影響

2.3 肉桂醛抑制膠質瘤細胞侵襲和遷移 與對照組相比，肉桂醛組侵襲細胞數(shù)量明顯降低（P＜0.05），劃痕距離明顯增大（P＜0.05）；而且，隨劑量增大，肉桂醛抑制細胞侵襲和遷移作用明顯增強（P＜0.05）。見圖3。

圖3 肉桂醛對膠質瘤U251細胞侵襲和遷移的影響

2.4 肉桂醛能抑制PI3K/Akt和Wnt/β-catenin信號通路 與對照組相比，肉桂醛組細胞p-PI3K/PI3K 比值、p-Akt/Akt 比值和cycling D、C-Myc、β-catenin 蛋白表達顯著降低（P＜0.05）；而且，隨劑量增大，肉桂醛對細胞PI3K/Akt 和Wnt/β-catenin 信號通路抑制作用顯著增強（P＜0.05）。見圖4。

圖4 肉桂醛對膠質瘤U251細胞PI3K/AKT和Wnt/β-catenin信號通路的影響

3 討論

目前，膠質瘤仍然是神經(jīng)外科最大的挑戰(zhàn)之一[6]。化療等技術雖然可以帶給病人良好的治療效果，但同時也會產生副作用損害身體。近年來，中醫(yī)藥防治神經(jīng)膠質瘤的探索與研究逐漸成為熱點。肉桂的主要活性成分肉桂醛能抑制多種腫瘤，但其潛在機制尚不完全清楚。本實驗結果表明肉桂醛可能通過Wnt/β-catenin 和PI3K/Akt 信號通路抑制神經(jīng)膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲，促進細胞凋亡。

研究表明，Wnt/β-catenin 信號通路的異常激活和β-catenin 的高表達與膠質瘤的異常組織學形態(tài)和細胞的異常增殖分化有關[7]。當β-catenin 在細胞質中積累到特定濃度時，開始轉向細胞核，并與核轉錄因子結合，導致下游靶基因啟動因子的激活，引起細胞異常增殖和凋亡抵抗，促進腫瘤的形成[8]。cycling D、C-Myc 是Wnt/β-catenin 信號通路的下游因子。cycling D 是調節(jié)細胞進入增殖期的主要因子，在多種腫瘤細胞中高表達，其異常表達會導致細胞周期運行失控和細胞惡性轉化[9]。C-Myc 是Wnt信號通路的靶基因。研究表明，肉桂醛可以通過抑制Wnt/β-catenin 信號通路抑制骨肉瘤細胞活性[10]。此外，肉桂醛還可以通過抑制Wnt/β-catenin 信號通路誘導非小細胞肺癌細胞凋亡并逆轉上皮-間充質轉化，從而達到遏制腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用[11]。本研

A.Transwell 小室檢測細胞侵襲的能力；B.劃痕實驗檢測細胞的遷移能力；與control 組相比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與40 μM 組相比，#P＜0.05，##P＜0.01；control.對照組；40 μM.低劑量肉桂醛組；80 μM.高劑量肉桂醛組究的結果反映肉桂醛通過下調β-catenin 以及下游靶蛋白cycling D、C-Myc的表達，抑制Wnt/β-catenin信號通路。此外，本實驗結果顯示肉桂醛顯著抑制PI3K 與Akt 的磷酸化，從而抑制PI3K/Akt 通路。PI3K/Akt通路在調節(jié)腫瘤細胞的增殖和生存中發(fā)揮重要作用[12]。PI3K/Akt 不僅抑制腫瘤細胞凋亡，而且誘導腫瘤細胞周期進展[13]。有研究報道激活Akt可以誘導多種抗凋亡蛋白的表達或通過多種信號耦合途徑抑制細胞凋亡[14]。Akt 是PI3K 信號通路中重要的下游靶點。Akt被激活后，可以通過磷酸化多種胞內底物蛋白來調節(jié)其活性。研究表明肉桂醛可以通過PI3K/AKT 通路抑制卵巢癌細胞的上皮間質轉化過程，從而抑制卵巢癌進展[15]。在人結直腸癌細胞中，肉桂醛可以通過抑制PI3K/Akt的轉錄功能，從而抑制腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲等生物學行為[16]。

本文存在一定的局限性，例如未采用基因沉默/過表達等方法明確肉桂醛是否通過PI3K/Akt和Wnt/β-catenin 信號通路來發(fā)揮抑制神經(jīng)膠質瘤作用。此外，本文僅用了一株神經(jīng)膠質瘤細胞系U251，還需使用多株細胞加以驗證。

綜上所述，肉桂醛抑制膠質瘤細胞增殖、侵襲、遷移，促進細胞凋亡，其機制可能與下調PI3K/Akt和Wnt/β-catenin信號通路有關。