膠體金免疫層析試紙條檢測芝麻過敏原

令狐曉盼，王 芮，陸 旸

(天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457)

食物過敏原主要是一組引發人類過敏反應的蛋白質.在過去的幾十年里，食物過敏報告在世界范圍內迅速增加.這種增加的原因被認為是由食物成分的多樣化、食物來源的多樣化、環境、文化習俗和食物監管措施等[1-3]引起的.

芝麻是一種全球農業作物，其產量從 1994年的230萬噸增加到 2017年的 550萬噸[4].芝麻是一種公認的、受國際監管的食物過敏原，芝麻過敏報告也在增加[5-9].與花生過敏一樣，免疫球蛋白 E(IgE)誘導的芝麻過敏在生命早期就開始了，通常在兩歲之前，并可能在80%的患者中持續一生[10-13].

經國際免疫學聯合會(International Union of Immunological Societies，IUIS)確認的芝麻中主要過敏原蛋白包括2種2S白蛋白Ses i 1和Ses i 2、1種7S球蛋白Ses i 3、2種油質蛋白Ses i 4和Ses i 5、2種11S球蛋白Ses i 6和Ses i 7[14-18]，其中2S白蛋白、11S球蛋白和7S球蛋白是主要的過敏原蛋白.2S白蛋白占芝麻總蛋白的 25%左右[19]，富含精氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺和半胱氨酸殘基[20].Ses i 1含有153個氨基酸，相對分子質量約為 9×104[15]，有較好的水溶性；Ses i 2含有148個氨基酸，相對分子質量約為7×104[16].研究[21-22]認為 2S白蛋白在通過胃腸道時就會發生過敏反應，其可以穿過腸道黏膜屏障，使黏膜系統處于過敏狀態并引起過敏反應.7S球蛋白中Ses i 3為主要的過敏原蛋白，相對分子質量約為4.5×104，由585個氨基酸構成，其缺乏二硫鍵.Ses i 3在經過胃腸道時容易被胃蛋白酶酶解，但不容易被胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶酶解，具有較好的抵抗力[23].2種油質蛋白Ses i 4、Ses i 5分別由166、153個氨基酸構成，相對分子質量在 1.5×104～1.7×104之間[17].2種11S球蛋白中Ses i 6由459個氨基酸構成，相對分子質量為5.3×104；Ses i 7由497個氨基酸構成，相對分子質量為 5.66×104，與 Ses i 3相似，易被胃蛋白酶消化，但對胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶具有較好的抗性.目前已知芝麻過敏原為Ses i 1—Ses i 7，其致敏反應主要由其抗原表位決定.目前國內對芝麻過敏原的限量還沒有明確規定，歐盟規定的芝麻過敏原在實際樣品中的限量標準為12.4mg/kg[24].

目前，芝麻過敏原最常用的檢測方法包括核酸檢測法、質譜(MS)法、酶聯免疫吸附測定(ELISA)法、實時熒光聚合酶鏈反應(real-time fluorescence PCR)法等.實時熒光聚合酶鏈反應以 DNA分子為模板，經過高溫變性、低溫退火和適溫延伸多次循環，使目的基因以接近指數級進行擴增.該方法廣泛應用于芝麻過敏原檢測與過敏原蛋白的提取[25]，但其對樣品處理、實驗環境和溫度要求嚴格.如果實驗環境污染或操作不當，就會造成假陽性或假陰性的結果.在免疫檢測法中，ELISA是廣泛用于芝麻過敏原檢測的方法，主要是由于其出色的靈敏度和操作的簡便性，但其孵育時間較長，檢測較為耗時.質譜技術的基本原理是將芝麻過敏原中的蛋白質酶解成多肽，將多肽混合物進行色譜分離后，再進行 MS或串聯MS(tandem mass spectrometry，MS/MS)分析，得到的數據與過敏原蛋白數據庫進行比對，從而鑒定過敏原蛋白質[26].該方法檢測限低，但要求專業人員操作，檢測時間長且樣品處理繁瑣.膠體金免疫層析檢測技術具有操作簡單、便攜、成本低、快速及不需要大型儀器等優點.該檢測技術是將免疫標記和色譜層析技術結合發展而來的一種用于檢測抗原和抗體的檢測技術.其檢測原理是基于毛細管作用力使樣品自發地從樣品墊向上層析，樣品與示蹤顆粒共同層析至信號發出區，由于抗原和抗體特異性結合以及示蹤顆粒上的信號輸出，通過示蹤顆粒在信號發出區產生的顏色就可以直接觀察檢測結果，從而對樣品進行定性與定量分析.因此該技術被廣泛應用于臨床診斷、食品檢測、目標分析物現場檢測等領域.

本課題組開發了膠體金免疫層析試紙條檢測芝麻過敏原，其檢測時間短，適用于商業化大規模生產.

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠芝麻單克隆抗體(Ab)由本團隊制備；牛血清白蛋白(BSA)、三水合四氯金酸(HAuCl4·3H2O)、檸檬酸三鈉(C6H5Na3O7)、聚乙二醇 200(PEG200)、聚乙二醇 20000(PEG20000)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，Sigma-Aldrich公司；羊抗鼠多克隆抗體(羊抗鼠二抗)，美國 Promega公司；膠體金免疫層析優化劑(SDS-L)、蔗糖、泊洛沙姆188溶液(F68)和三羥甲基氨基甲烷(Tris)，生工生物工程(上海)股份有限公司；硝酸纖維素(NC)膜(HF135s)，美國 Millipore公司；聚氯乙烯吸收墊、樣品墊和結合墊，上海金標生物科技有限公司；食品樣品為超市購買.

所有溶液均用電阻率為 18MΩ·cm 的去離子水配制.將1.21g Tris、5g蔗糖、0.5g BSA和0.5g PVP溶解在 100mL去離子水中配制金標抗體工作溶液.在使用前分別加入 5mL F68、0.5mL PEG200和1mL SDS-L.

使用平臺分配器和可編程條帶切割機(上海金標生物科技有限公司)分別在膜上劃上涂層抗原或羊抗鼠多克隆抗體.

1.2 芝麻過敏原的提取

將芝麻充分研磨，芝麻粉與丙酮以 1∶10(g∶mL)的比例混合，在 4℃冰箱中磁力攪拌 2h，4℃、8000r/min離心 30min后得到沉淀，該沉淀需要重復脫脂 3～4次.將該沉淀放置于通風櫥中過夜，使有機試劑揮發完全，得到干燥的、無脂肪的芝麻粉末.稱量上述所得脫脂粉末，按照每克樣品加入5mL 50mmol/L Tris-HCl緩沖液(含 1.0mol/L NaCl，pH 8.0)的比例提取蛋白，并于 4℃條件下磁力攪拌過夜；在 4℃、11000r/min條件下離心 15min，取上清液置于 4℃冰箱中，此上清液即為芝麻過敏原浸提液.將前一步驟中獲得的溶液置于透析袋中，用夾子密封透析袋，在 4℃冰箱中用 PBS緩沖液透析 3d，每 4h更換一次透析液.將透析好的芝麻過敏原置于-20℃冰箱保存.

1.3 膠體金的合成

向鉻酸溶液浸泡處理過的三角瓶中加入足量的雙蒸水，放置于恒溫加熱磁力攪拌器上，加熱至沸騰，約 2min后倒掉沸水.量取 99mL雙蒸水并與1mL 1%氯金酸溶液混合，攪拌均勻后加熱至沸騰.準確量取 2.25mL 1%檸檬酸三鈉溶液迅速加入上述溶液中，約 2min后可觀察到溶液的顏色發生變化，直至最終呈現穩定的酒紅色；用雙蒸水定容至100mL，4℃避光保存.

1.4 金標抗體的制備

將芝麻單克隆抗體加到 1mL膠體金溶液中，并用 0.2mol/L碳酸鉀(K2CO3)溶液調節 pH，混合均勻后置于 4℃冰箱中避光反應 1h；加入 20% BSA 溶液和 10% PEG20000溶液，反應 30min.在 4℃、2000r/min條件下離心 15min，取上清液；在 4℃10000r/min條件下離心30min，得到金標抗體.用金標工作液復溶金標抗體，置于4℃冰箱中避光保存.

1.5 實驗條件優化

1.5.1 金標抗體制備中碳酸鉀溶液添加量和抗體的優化

在實驗中，C線包被羊抗鼠二抗作為質控線，T線包被芝麻過敏原作為檢測線.在金標抗體制備過程中，抗體(1mg/mL)添加量分別為 2.5、5、10μL，0.2mol/L K2CO3溶液添加量分別為 1、3、5、7μL，制備完成后根據試紙條顯色情況確定最佳抗體添加量和K2CO3溶液添加量.

1.5.2 羊抗鼠二抗和包被原稀釋倍數的選擇

用 PBS緩沖液將芝麻過敏原溶液(4mg/mL)分別稀釋 4、8、16倍，羊抗鼠二抗分別稀釋 10、15、20倍，劃膜后置于 37℃烘箱中干燥 6h，組裝試紙條，將金標抗體(AuNPs-Ab)探針與 100μL上樣緩沖液混合滴加到樣品墊上，觀察結果.選擇T線和C線顏色較為一致的稀釋倍數作為實驗條件.

1.5.3 AuNPs-Ab添加量的優化

分別取 0.5、0.7、0.9、1.1μL AuNPs-Ab與 100μL PBS緩沖液混合進行免疫層析試紙條實驗，觀察試紙條結果，選擇最佳的AuNPs-Ab添加量.

1.5.4 上樣緩沖液的選擇及pH的優化

分別取 100μL PB、PBS、PBST、BB 上樣緩沖溶液與AuNPs-Ab混合后進行免疫層析試紙條實驗，根據試紙條 C線、T線的出線情況，確定最適上樣緩沖液.

根據上述確定好的上樣緩沖液，對上樣緩沖液pH 進行優化，分別用不同 pH(5.7、7.4、8.5)的 PBS緩沖液與 AuNPs-Ab混合后進行免疫層析試紙條實驗，根據試紙條 C線、T線的出線情況，選擇條帶清晰、背景干擾小的實驗結果所對應的 pH作為上樣緩沖液pH.

1.6 試紙條檢測限的確定

用上樣緩沖液稀釋芝麻過敏原標準品，終質量濃度為 31、62、125、250、500、1000μg/L，分別添加等量的 AuNPs-Ab，混合均勻后滴加到樣品墊上，20min后觀察試紙條C線、T線條帶.隨著標準品質量濃度的增加，試紙條C線顏色保持不變，T線顏色逐漸減弱；當標準品質量濃度增大到一定程度時，試紙條 T線消失，此時標準品的質量濃度就是膠體金免疫層析試紙條的檢測限.

1.7 膠體金免疫層析法特異性的測定

為了評估該方法的特異性，選取了4種常見的過敏原蛋白進行測定，分別為核桃蛋白、花生蛋白、羽扇豆蛋白、BSA.若在C線、T線均有紅色條帶出現，則說明該方法對其他過敏原有交叉反應.用于特異性測定的芝麻蛋白的質量濃度為 1mg/L，其余 4種蛋白質的質量濃度為10mg/L，觀察T線條帶顏色變化，對該方法的特異性進行評價.

1.8 膠體金免疫層析法測定實際樣品

選取 3種不含芝麻過敏原的實際樣品餅干、面包、火腿進行加標回收實驗.樣品添加芝麻過敏原標準溶液(0.5、2.0、8.0mg/kg)，經基質消除后用PBS緩沖液稀釋8倍，20min后觀察試紙條C線、T線條帶的顏色變化.

2 結果與討論

2.1 芝麻過敏原蛋白的提取

白芝麻經鹽析法粗提蛋白后，使用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對所提取的蛋白進行鑒定，結果如圖1所示.

從圖1中可以看出，所提取的全蛋白相對分子質量為 1.1×104～1.7×104、3.0×104～3.5×104、4.8×104.這其中含有 Ses i 1和 Ses i 2(0.7×103～1.1×104)、Ses i 3(4.8×104)、Ses i 4 和 Ses i 5(1.5×104～1.7×104)主要過敏原蛋白，除了相對分子質量 3.5×104不是芝麻主要過敏原蛋白的，其他均為芝麻中主要過敏原蛋白的相對分子質量.

圖1 芝麻過敏原蛋白的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of sesame allergens protein

2.2 羊抗鼠二抗和包被原稀釋倍數的優化

從提高檢測方法靈敏度和節約成本的角度考慮，對試紙條包被原和羊抗鼠二抗稀釋倍數進行優化.芝麻過敏原蛋白包被原(4mg/mL)和羊抗鼠二抗(100μg/mL)的稀釋倍數優化結果見表1.隨著羊抗鼠二抗和包被原稀釋倍數的增加，C線、T線顏色都逐漸變淺；當包被原稀釋倍數為 8倍、羊抗鼠二抗稀釋倍數為 15倍時，試紙條的 C線、T線顏色深淺適中且一致.因此，選擇芝麻過敏原蛋白包被原稀釋 8倍、羊抗鼠二抗稀釋15倍進行后續實驗.

表1 羊抗鼠二抗和包被原稀釋倍數的優化Tab.1 Optimization of titration of goat anti-mouse secondary antibody and the coating antigen

2.3 金標抗體制備中 K2CO3溶液添加量和抗體添加量的優化

在金標抗體的制備過程中，K2CO3溶液添加量會影響溶液的 pH，進而影響膠體金與抗體的偶聯效果，因此本實驗對K2CO3溶液添加量進行了優化.在金標抗體的制備過程中，K2CO3溶液(0.2mol/L)添加量分別為 1、3、5、7μL，制備得到 AuNPs-Ab.如圖2(a)所示，當 K2CO3溶液添加量為 1μL和 3μL時，試紙條C線、T線顏色較淺；當K2CO3溶液添加量為5μL時，試紙條C線的顏色比T線的深，C線、T線顏色不一致；當K2CO3溶液添加量為7μL時，C線、T線的顏色清晰且一致.因此，選擇K2CO3溶液添加量7μL為最優條件.

抗體的添加量會影響方法的靈敏度和檢測限，抗體添加量越少靈敏度越高.在保證C線、T線出線情況一致的前提下降低抗體的添加量，不僅可以提高靈敏度，而且還可以節約成本.因此，對抗體的添加量進行優化，抗體添加量分別為2.5、5、10μL制備得到AuNPs-Ab.如圖2(b)所示，抗體添加量為 2.5μL時，T線的顏色比 C線的淺；抗體添加量為 5μL和10μL時，C線、T線顏色較為一致，考慮試劑成本及靈敏度，選擇抗體添加量5μL為最優條件.

圖2 金標抗體制備中 K2CO3溶液添加量和抗體添加量的優化Fig.2 Optimization of additional K2CO3 solution volume and the antibodies volume in the preparation of gold-labeled antibodies

2.4 AuNPs-Ab添加量的優化

AuNPs-Ab作為檢測探針，其添加量將決定能否使試紙條 T線消線，同時也決定了試紙條的靈敏度.因此，對 AuNPs-Ab添加量進行優化.按照上述優化好的條件，向上樣緩沖液中分別添加 0.5、0.7、0.9、1.1μL AuNPs-Ab后上樣，觀察C線、T線出線情況，結果如圖3所示.隨著 AuNPs-Ab添加量的增加，C線顏色適中且一致，T線顏色逐漸加深；當AuNPs-Ab添加量為 0.9μL時，條帶顏色與 AuNPs-Ab添加量為 1.1μL 的 T線條帶顏色幾乎一致.因此，從提高試紙條靈敏度方面考慮，選擇 0.9μL為AuNPs-Ab最優添加量.

圖3 AuNPs-Ab添加量優化結果Fig.3 Optimization results of the additional volume of AuNPs-Ab

2.5 上樣緩沖液種類及pH優化

上樣緩沖液為探針、樣品、試紙條的C線和T線包被的物質提供了反應環境，其可能會影響試紙條C線、T線的清晰度.因此，對上樣緩沖液的種類進行了優化.將AuNPs-Ab、工作液分別與pH 7.4的PB、PBS、PBST、BB上樣緩沖液混合，上樣后觀察C線、T線顏色情況，確定最佳的上樣緩沖液種類.如圖4(a)所示：當用pH 7.4PBS緩沖液上樣時，試紙條C線、T線顏色較為一致，顏色適中；BB緩沖液使 C線、T線顏色較淺；然而用PB、PBST上樣緩沖液時，試紙條 C線、T線顏色不一致.所以，確定最佳上樣緩沖液為PBS緩沖液.

上樣緩沖液的 pH對抗體活性有一定的影響，進而影響抗原和抗體的結合，并反映在 C線、T線顏色的深淺上，所以對PBS緩沖液的pH進行優化.如圖4(b)所示，可以看出：使用pH 5.7的PBS緩沖液時，C線、T線的顏色較淺；使用pH 8.5的PBS緩沖溶液時，C線、T線不一致；使用 pH 7.4的 PBS緩沖液時，C線、T線顏色適中且一致.這可能是因為抗體在中性環境中比較穩定.因此，選擇 pH 7.4的 PBS緩沖液作為最優條件進行后續實驗.

圖4 上樣緩沖液種類及pH優化Fig.4 Optimization of different solution buffers and pH

2.6 膠體金免疫層析法芝麻過敏原檢測限的確定

在上述優化條件下，配制不同質量濃度的芝麻過敏原標準品進行測定.隨著芝麻過敏原標準品質量濃度的增加，芝麻過敏原與AuNPs-Ab的結合量逐漸增多，故試紙條 T線包被的蛋白與 AuNPs-Ab的結合量就會減少.對于可視化檢測，其可視化檢測限(vLOD)定義為 T線顏色明顯弱于 C線時芝麻過敏原的最低質量濃度，檢測限(LOD)定義為 T線條帶消失所對應的芝麻過敏原的質量濃度.從圖5可以看出：隨著芝麻過敏原質量濃度的增加，試紙條 C線顏色適中且保持穩定，試紙條 T線顏色逐漸變淺直至消失.當芝麻過敏原質量濃度為 31μg/L時，T線顏色明顯比 C線淺；當芝麻過敏原質量濃度為1000μg/L時，T線顏色消失.以上結果說明該方法的vLOD和LOD分別為31μg/L和1000μg/L.

圖5 膠體金免疫層析試紙條的檢測限Fig.5 Detection limit of colloidal gold immunochromatographic test strips

2.7 膠體金免疫層析法的特異性

用PBS緩沖液將核桃蛋白、花生蛋白、羽扇豆蛋白、BSA稀釋成質量濃度為10mg/L的標準品，將芝麻過敏原稀釋成質量濃度為1000μg/L的標準品，按照上述優化好的條件上樣，根據試紙條結果進行判定.膠體金免疫層析試紙條的特異性結果如圖6所示.

圖6 膠體金免疫層析試紙條的特異性Fig.6 Specificity of colloidal gold immunochromatographic test strips

由圖6可知：芝麻過敏原標準品能夠與 AuNPs-Ab特異性結合使試紙條 T線條帶消失；然而其他 4種高質量濃度的常見過敏原標準品溶液均不能與AuNPs-Ab結合，游離的AuNPs-Ab與T線處的過敏原蛋白結合，導致試紙條 T線條帶出現.這說明AuNPs-Ab只能與其對應的過敏原結合，與其他常見過敏原不存在交叉反應.因此，膠體金免疫層析試紙條與其他4種常見的過敏原蛋白無交叉反應，特異性良好.

2.8 膠體金免疫層析法測定實際樣品的特異性

對 3種不含芝麻過敏原的實際樣品(餅干、面包、火腿)進行加標回收實驗的測定.樣品添加芝麻過敏原標準溶液(0.5、2.0、8.0mg/kg)，經基質消除后用 PBS緩沖液稀釋 8倍進行測定，每個實驗重復 3次，結果如圖7所示.隨著標準品含量的增加，C線顏色保持不變，T線顏色逐漸消失，與標準品檢測方法的檢測限結果一致.

圖7 膠體金免疫層析試紙條測定實際樣品的特異性Fig.7 Specificity of colloidal gold immunochromatographic test strips in the determination of real samples

3 結 論

本實驗開發了膠體金免疫層析試紙條法.AuNPs-Ab作為檢測探針檢測芝麻過敏原.經優化，芝麻過敏原包被原質量濃度為 0.5mg/mL，羊抗鼠二抗質量濃度為 6.6μg/mL，分別包被于試紙條的 C線、T線.選用 pH7.4的 PBS緩沖溶液為上樣緩沖液.AuNPs-Ab探針制備時選擇 7μL K2CO3溶液(0.2mol/L)添加量和 5μL抗體(1mg/mL)添加量連接 AuNPs.之后，優化 AuNPs-Ab添加量為 0.9μL.在上述優化條件下，該方法的檢測限為 1000μg/L.最后對餅干樣品、面包樣品、火腿樣品進行了加標回收實驗，3種樣品的檢測限均為8mg/kg，與標準溶液的檢測限一致，并且可在20min內完成檢測.本方法的實際樣品檢測限低于歐盟的限量標準.