西藏五個鹽湖浮游生物組成與微生物多樣性

楊 歡，高美榮，韓學凱，段 虎，王振乾，隋麗英

(亞洲區域鹵蟲參考中心，天津科技大學海洋與環境學院，天津 300457)

西藏蘊藏著豐富的鹽湖資源.西藏鹽湖多為碳酸鹽型或硫酸鹽型鹽湖，主要分布在平均海拔為 4000～4500m 西藏北部的那曲市和阿里地區[1].該地區的主要氣候特征為輻射強、日照短、氣溫低、降水少和氣壓低等.20世紀 60年代，我國科技工作者開始進行西藏鹽湖生態和生物資源的調查研究[2-4].雖然大多數西藏鹽湖為寡營養狀態，但仍從中發現了具有經濟價值的浮游動植物，包括螺旋藻(Spirulina sp.)、杜氏鹽藻(Dunaliella sp.)、褶皺臂尾輪蟲(Brachionus plicatilis)、蘿卜螺(Radix sp.)、西藏擬蚤(Daphniopsis tibetana)和鹵蟲(Artemia sp.)等[5-7].西藏鹽湖鹵蟲資源已被成功地進行了商業化開發，帶來可觀的經濟效益.研究人員對鹵蟲的分類[8]、種群分布[6,9-10]、種質特征[11-12]及其在海洋魚類[13]和凡納濱對蝦[14]等經濟水產動物養殖中的應用進行研究.隨著培養方法的改進和分子生物學技術的發展，人們對西藏鹽湖微生物的多樣性、豐度及其與環境因素之間的關系有了更多的認識[15].研究人員通過構建系統發育樹發現了一些新的原核生物分支[16].雖然西藏鹽湖生物資源研究取得了一些進展，但由于藏北地區氣候惡劣、交通不便，許多鹽湖的生物資源情況仍不清楚.

本研究對我國西藏的那曲市和阿里地區的30個湖泊進行調查.采集了當穹錯、班戈錯、洞錯、聶爾錯和鹽湖鄉5個鹽湖的水體和底泥樣品，進行了湖水離子組成分析、浮游生物種群組成(特別是鹵蟲)檢測、底泥微生物多樣性分析以及細菌的分離鑒定，旨在分析鹽湖的微生物多樣性及浮游生物組成，為西藏鹽湖資源的開發利用奠定理論基礎.

1 材料與方法

1.1 鹽湖信息

2019年9 月和2020年7月，對我國西藏北環沿線 30個湖泊進行了調查(圖1).鹽湖的水體鹽度和地理信息見表1.對其中鹽度超過40的5個鹽湖(當穹錯、班戈錯、洞錯、聶爾錯和鹽湖鄉)進行了浮游生物組成和微生物多樣性分析.

圖1 西藏鹽湖生物資源考察路線圖Fig.1 Route map for investigation of biological resources in Tibet salt lakes

表1 鹽湖的水體鹽度和地理信息Tab.1 Water salinity and geographic information of salt lakes

1.2 水樣理化參數分析

用溫度計和鹽度計(日本 ATAGO公司)現場測定水體的溫度和鹽度.將水樣帶回實驗室，用 pH計(美國Mettler Toledo公司)測定pH.5個鹽湖水樣的主要離子組成參照文獻[17]的方法進行測定：重量法測定和 K+，酸堿滴定法測定，絡合滴定法測定 Cl-、Mg2+和 Ca2+，電感耦合法測定 Na+.

1.3 浮游生物組成及鹵蟲種群分析

使用 25#浮游植物網和 13#浮游動物網(北京普瑞特儀器有限公司)過濾收集5個鹽湖的浮游植物和浮游動物，并將樣品放置在密封塑料瓶中，加入 37%甲醛溶液進行固定.在DM500型顯微鏡(德國Leica公司)和 SZ2-ILST型體視顯微鏡(日本 Olympus公司)下觀察樣品中的浮游生物，參考分類學專著對浮游動植物種類進行鑒定[18-20].

采用浮游生物網(孔徑150μm)過濾20L湖水收集鹵蟲，每個鹽湖設定 5個采樣點共 100L水體(以鹽湖中心為第1個取樣點，分別向四周延伸50m設定其他 4個取樣點).將鹵蟲樣品置于塑料瓶中，添加甲醛溶液進行固定.根據發育階段，將鹵蟲分為無節幼體、后無節幼體、幼蟲和成蟲 4個類群.在體視顯微鏡下觀察并統計不同發育階段的鹵蟲、雌性和雄性成蟲的數量，計算鹵蟲種群密度、雌性/雄性比例、無節幼體/后無節幼體/幼蟲/成蟲的比例.種群密度為每立方米水體中鹵蟲個體的總數.

1.4 鹽湖底泥微生物多樣性分析

使用天根生化(北京)科技公司的TIANamp細菌基因組 DNA提取試劑盒提取 5個鹽湖底泥樣品的基因組 DNA，送至北京諾禾致源科技股份有限公司進行高通量測序.使用通用細菌引物 515F/806R擴增16SrDNA基因的V4片段.PCR反應條件：98℃預變性1min；98℃變性10s，50℃退火30s，72℃延伸 30s，30個循環；72℃延伸 5min終止反應.用純化試劑盒(德國 Qiagen公司)對 PCR產物進行純化.使用 TruSeq?DNA PCR-Free試劑盒(美國 Illumina公司)制備文庫.采用 Qubit@2.0型熒光儀(美國Thermo Scientific公司)和 Agilent Bioanalyzer 2100系統評估文庫質量，在Illumina NovaSeq平臺上進行測序，輸出 250bp片段的信息.利用 UPARSE軟件進行序列分析，將相似性≥97%的序列歸為相同的操作分類單元(OTUs)，對每個 OTUs的代表性序列進行篩選，以便進一步注釋.根據 OTUs計算香農-維納多樣性指數(H)和辛普森多樣性指數(D)，以評估各樣本的微生物多樣性.通過物種的相對豐度和典型關聯分析(CCA)，比較不同鹽湖中的微生物群落組成.

1.5 鹽湖底泥微生物的分離鑒定

根據鹽湖水樣的鹽度和主要離子組成配制培養基，并添加 10g/L酵母提取物和 7.5g/L酸水解酪蛋白作為營養物質.取5g底泥，加入100mL新鮮培養基，28℃培養1d，之后將3mL上清液轉入新鮮培養基，28℃富集培養 3～4d.將富集后的菌液分別稀釋10-5、10-6和 10-7后涂布到固體培養基上，28℃培養7d.挑取不同形態、顏色、大小的單菌落，轉入新鮮的液體培養基，并通過劃線法純化菌株.使用華大基因合成的通用引物(27F：5′-AGAGTTTGATCCTGG CTCAG-3′；1492R ：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)擴增分離菌株的 16SrDNA 序列并測序.測序結果在美國國家生物技術信息中心(NCBI)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數據庫進行比對分析，選取相似性≥99%的比對結果作為菌種鑒定依據.

2 結果與分析

2.1 鹽湖水樣的主要離子組成

當穹錯、班戈錯、洞錯、聶爾錯和鹽湖鄉水樣鹽度均超過40，pH為7.66～9.38，均為堿性鹽湖.根據離子組成分析結果和鹽湖分類標準[21]，確定當穹錯、班戈錯為碳酸鹽型鹽湖，洞錯、聶爾錯和鹽湖鄉為硫酸鹽型鹽湖(表2).

表2 鹽湖的鹽度、溫度、pH和離子組成Tab.2 Salinity，temperature，pH and ion composition of the salt lakes

2.2 鹽湖水樣的浮游植物組成

5個鹽湖浮游植物樣品中共發現 5門 36屬 53種浮游植物(包含未定種)，其中硅藻門11屬25種，綠藻門14屬15種，藍藻門9屬11種，黃藻門1種，裸藻門1種(表3).

表3 鹽湖中的浮游植物種類Tab.3 Phytoplankton species in the salt lakes

2.3 鹽湖水樣的浮游動物組成

在5個鹽湖水樣中均發現了鹵蟲卵或鹵蟲幼體，在洞錯鹽湖水樣中發現了 3種輪蟲為褶皺臂尾輪蟲(Branchionus plicatilis)、壺狀臂尾輪蟲(B.urceolaris)、小種輪蟲(B.rotundiformis)，以及 2種橈足類為新月北鏢水蚤(Arctodiaptomus stewartianus)和鋸齒棘猛水蚤(Attheyella dentata).對班戈錯、聶爾錯和當穹錯 3個鹽湖的鹵蟲成蟲性別比例、種群密度和組成進行了統計分析.結果表明，成蟲雌性/雄性的比例為1.0∶1～1.9∶1，其中當穹錯雌性占比最高.班戈錯鹵蟲種群密度為 6×104m-3，遠高于其他鹽湖.各鹽湖無節幼體/后無節幼體/幼蟲/成蟲的比例也有差異，其中聶爾錯以成蟲為主(表4).

表4 鹵蟲的性別比、種群密度和種群組成Tab.4 Sex ratio，population density and population composition of Artemia

2.4 鹽湖底泥的微生物多樣性

香農-維納多樣性指數表示樣品中的分類總數及其占比，辛普森多樣性指數表征群落內物種分布的多樣性和均勻度.洞錯鹽湖底泥的這兩個指數均高于其他 4個鹽湖，表明其微生物多樣性最豐富.除了班戈錯外，其余鹽湖底泥的微生物多樣性與水體鹽度有關，鹽度越高微生物多樣性越低(表5).

表5 鹽湖底泥的微生物多樣性分析Tab.5 Analysis of microbial diversity of salt lake sediments

CCA分析表明，影響洞錯鹽湖底泥微生物多樣性的主要因素是 pH和鹽度，而當穹錯和班戈錯鹽湖底泥的微生物多樣性主要與鹽湖中和濃度有關(圖2).

圖2 鹽湖底泥微生物多樣性與 、、pH、鹽度的典型關聯分析Fig.2 Canonical correlation analysis of sediment microorganisms correlated with and content，pH and salinity

根據OTUs聚類分析，獲得了鹽湖底泥微生物中相對豐度較高的 10個屬，其中：當穹錯鹽湖底泥微生物的優勢屬為堿擾菌屬(Alkaliflexus)，所占比例為33%；鹽湖鄉鹽湖底泥微生物的優勢屬為Salipaludibacillus，所占比例為 12.0%；班戈錯鹽湖底泥微生物的優勢屬為鹽單胞菌屬(Halomonas)，所占比例為 9.0%；聶爾錯鹽湖底泥微生物的優勢屬為粉色海生菌屬(Roseimarinus)，所占比例為 8.1%；洞錯鹽湖底泥微生物的優勢屬為 Izimaplasma，所占比例為 2.3%(表6).

表6 鹽湖底泥微生物中相對豐度較高的10個屬Tab.6 Top 10 bacterial genus of relative abundance in salt lake sediments

2.5 鹽湖底泥微生物的分離鑒定

篩選菌落形態、顏色、大小不同的 28株菌，進行16SrDNA分子鑒定.比對結果發現，其中27株鑒定到屬(表7).在門水平上，大部分菌株屬于變形菌門(Proteobacteria，20株，71.43%)，其次是厚壁菌門(Firmicutes，5株，17.86%)和放線菌門(Actinobacteria，2株，7.14%).在屬水平上，大部分菌株屬于鹽單胞菌屬(Halomonas，13株，46.43%)，其次是鹽弧菌屬(Salinivibrio，3株，10.71%)、嗜鹽嗜堿菌屬(Alkalibacterium，2 株，7.14%)、芽孢桿菌屬(Bacillus，2 株，7.14%)和海源桿菌屬(Idiomarina，2株，7.14%).

表7 鹽湖底泥中分離的微生物Tab.7 Microorganisms isolated from salt lake sediments

續表

3 討 論

研究位于我國西藏那曲市和阿里地區 5個鹽湖的浮游生物發現，鹽度是影響高鹽環境中生物多樣性和豐度的主要參數.隨著水體鹽度的增加，生物多樣性逐漸減少，但耐鹽生物的種群密度則會逐漸提高[22].本研究在鹽度范圍 40～110的 5個鹽湖水樣中，共鑒定到 5門 36屬 53種浮游植物(包含未定種)，其中硅藻門、藍藻門和綠藻門的種類較多.在這些鹽湖中還發現了以浮游植物為食的小型甲殼浮游動物鹵蟲，在低鹽度鹽湖(洞錯)中除鹵蟲外，還存在耐鹽的輪蟲、水蚤和橈足類等，而在中、高鹽度鹽湖水樣中沒有發現其他浮游動物.研究人員[23-26]對西藏地區鹽湖浮游植物種類的研究發現，硅藻門占比最高，這與本研究結果一致(見表8).

表8 與調查區域相近的鹽湖浮游生物和微生物研究Tab.8 Research on plankton and microorganism in salt lake similar to the surveyed zone

硅藻門在西藏鹽湖中廣泛分布且具有較高的多樣性.究其原因，西藏鹽湖平均水溫較低，而硅藻對低溫的耐受力較強，在水溫較低的情況下易成為優勢種.崇璘璇等[24]對西藏多格錯仁鹽湖(鹽度 135～140)的浮游植物群落結構進行了分析，在 58個站點中共發現了310種浮游植物，但在靠近中心的站點種類較為單一，如 N38表層水體中僅發現了 13種硅藻.相較而言，本研究中的浮游植物種類更為豐富.霍元子等[27]對內蒙古錫林郭勒盟的鹽湖浮游生物的群落特征進行研究，共檢出59種浮游植物和34種浮游動物.與之相比，西藏鹽湖浮游生物多樣性較低，且兩者的優勢藻存在差異，這可能與西藏所處的特殊高原環境有關.

目前，鹵蟲是西藏鹽湖中唯一商業化的生物資源，可用于觀賞魚、海水魚蝦等經濟水產動物的養殖[13-14].2020年西藏鹽湖(其香錯和拉果錯)的鹵蟲卵總產量超過 600噸，占中國總產量的 1/3.20世紀90年代初，研究人員從西藏拉果錯鹽湖收集了鹵蟲并進行分類研究，將其定為西藏鹵蟲(A.tibetiana)[8].本研究統計發現鹵蟲成蟲雌性/雄性的比例為 1.0∶1～1.9∶1，表明這些鹽湖存在兩性鹵蟲.不同年份之間鹽湖鹵蟲的種群密度和鹵蟲卵產量存在較大差異，推測其主要影響因素為氣候和生態環境.7月份班戈錯的鹵蟲種群密度為 6.6×104m-3，遠高于聶爾錯(2.3×103m-3)和當穹錯(2.1×103m-3).在相同季節，渤海灣鹽場鹵水處于富營養狀態，鹵蟲的種群密度為 2×104～7×104m-3[30].由此可見，班戈錯的鹵蟲種群密度與渤海灣鹽場相近.然而西藏年平均氣溫較低[1]，導致鹵蟲生長和傳代緩慢.

西藏鹽湖蘊藏了豐富的微生物資源，其中大部分為耐鹽或嗜鹽微生物[6,10].CCA分析表明，5個鹽湖底泥的微生物多樣性與陰離子濃度、pH和水體鹽度有關.其中濃度和 pH是影響微生物組成的主要因素，其次是鹽度和濃度.同處于青藏高原的小柴旦鹽湖屬于硫酸鹽型鹽湖，與聶爾錯鹽湖類似，但其總鹽度(108.82～113.84)高于聶爾錯鹽湖的總鹽度，接近于當穹錯鹽湖的總鹽度.當穹錯和聶爾錯鹽湖底泥微生物的優勢屬分別為 Alkaliflexus(33%)和Roseimarinus (8.1%)，但在小柴旦鹽湖水樣和底泥混合樣品中芽孢桿菌屬(Bacillus)為優勢屬，約占21.53%[28].此外，新疆艾比湖(鹽度約為 112.4)也屬于硫酸鹽型鹽湖，其優勢屬為 Halofilum[31].這表明除了鹽度外，湖泊的化學組成也會影響微生物多樣性.由于鹽湖和鹽場的氣候和生態特征不同，分離獲得的菌株也存在較大差異.黃建蓉[31]從青藏高原北部6個不同鹽度湖泊中分離獲得了4門90屬210種微生物.上述研究中分離得到的微生物除Halomonas和 Bacillus外，其余均與本研究不同.這可能與湖水的離子組成及所處環境有關.本研究從鹽度為 40～110的5個鹽湖中分離出13個具有不同形態特征的Halomonas菌株，表明 Halomonas耐鹽范圍較廣.不僅如此，Halomonas在新疆達坂鹽湖、羅布泊鹽湖和四川大古鹽井中均有分布，且均為優勢菌群[32].Halomonas富含多種生物活性物質，如聚羥基脂肪酸、四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶、堿性酶等，這些活性物質在化妝品、生物醫藥和水產養殖等領域中具有廣闊的應用前景[33-34].因此，Halomonas作為天然代謝產物的物質基礎，具有較高的研究價值和開發利用價值.此外，本課題組發現通過高通量測序得到的微生物種類明顯多于分離獲得的菌株，而菌株的分離培養是對其進行深入研究的基礎，因而高效分離培養基的設計和培養方法的改進仍是未來研究的重要方向.

4 結 語

本研究對我國西藏北部那曲市和阿里地區的 5個鹽湖進行了湖水離子組成分析、浮游生物檢測、底泥微生物多樣性分析以及分離篩選，發現西藏鹽湖中的主要浮游動物為鹵蟲，且多為兩性鹵蟲，其種群密度和鹵蟲卵產量受氣候和環境影響較大.不同鹽湖細菌的優勢屬種類均不相同，有其獨特的菌群結構.鹽湖底泥微生物多樣性與鹽度成反比，但在高鹽鹽湖中優勢菌群的占比更高.除了鹽度外，鹽湖的化學組成也會影響微生物群落結構.本研究結果為西藏鹽湖生物資源的開發利用奠定了理論基礎.

致謝：本項目得到中國農業農村部漁業漁政管理局援藏項目的支持.感謝天津科技大學張翠霞老師在樣本浮游動植物分析方面的支持，以及郭亞飛、李瓏和王士強老師在水樣離子組成分析中給予的幫助.