解磷細菌強化煤矸石肥力及影響因素研究*

譚詩詠 鄧 敏 程 蓉 舒榮波 魏紫靜 楊 剛

(1.四川農業大學環境學院,四川 成都 611130；2.中國地質科學院礦產綜合利用研究所,四川 成都 610041；3.四川農業大學生態環境研究所,四川 成都 611130)

煤炭開采及加工過程會產生大量煤矸石,一般占煤炭總產量10%～15%[1],目前我國有煤矸石山1 500多座,侵占土地約1.5×104km2,已成為我國產出量最大的工業固體廢物之一[2]。大量煤矸石無序堆放,污染水土,破壞生態環境。煤矸石具有硫分含量高、養分含量低、持水保肥性能差等特點[3],這對于矸石堆場生態恢復工作造成極大困難。因此,本研究擬借助微生物提升煤矸石養分含量,形成植物適宜的生長環境,后期再補以耐受性植物形成完整的煤矸石生態復綠技術體系,這對于煤矸石生態恢復治理具有重要現實意義。

添加外源微生物是提升煤矸石肥力的方法之一,該法是利用微生物自身代謝以及微生物與煤矸石之間相互作用來改善煤矸石養分含量[4],具有高效、經濟、清潔并能減輕污染物對人類健康危害[5-6]等優點。解磷細菌是一類能分泌胞外磷酸酶和有機酸的細菌總稱,能使煤矸石中難溶性無機磷和鉀釋放[7],從而促進植物對其的吸收利用。研究表明,利用解磷細菌處理煤矸石可明顯提高其養分含量。鐘艷等[8]用巨大芽孢桿菌處理低硫煤矸石后樣品中堿解氮、有效磷和速效鉀較初始樣品分別提高1.27、33.96、6.83倍。李夏夏[9]發現,從風化土壤中篩選出的類香味細菌對煤矸石具有較好的解磷效果。賈倩倩等[10]利用硅酸鹽細菌處理煤矸石后樣品中有效磷和速效鉀比原料分別提高了3.95、2.75倍,同時發現細菌分解能力隨原料粒度的減小而增加。馮廣達[11]23-24研究發現,粉煤灰中添加解磷細菌能顯著提高淋濾液中的元素碳和磷含量。孔濤等[12]研究發現,接種膠質芽孢桿菌能顯著提高土壤速效鉀含量,與根瘤菌雙接種能有效提高礦區排土場土壤復墾效果。

目前,國內外的研究主要集中在微生物對煤矸石的表觀作用效果,而對于微生物與煤矸石的相互作用機制研究仍較少。因此,本研究擬以廢棄煤矸石為研究對象,以解磷細菌巨大芽孢桿菌Bacillusmegateriumstrain B1(簡寫為B1)和地衣芽孢桿菌Bacilluslicheniformisstrain B2(簡寫為B2)為供試菌株,通過單因素培養實驗、吸附實驗以及掃描電子顯微鏡(SEM)、Zeta電位、傅立葉紅外光譜(FT-IR)表征,研究解磷細菌對煤矸石基礎肥力的強化效果及其作用機制,以期為煤矸石堆場生態恢復提供基礎理論和技術支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 供試煤矸石

煤矸石原料取自四川省攀西地區某矸石堆場,其基本理化性質：pH為9.36；有機質為122.80 g/kg,全氮、堿解氮、有效磷、速效鉀、全磷分別為150.00、55.40、7.22、287.00、448.50 mg/kg；其主要化學成分SiO2、Al2O3、K2O、Fe、MgO、TiO2、Na2O、CaO、S、P2O5、F、Cl分別為510.3、180.6、29.5、29.4、17.3、8.2、3.7、3.3、1.86、0.87、0.67、0.45 g/kg。

1.1.2 供試菌株

B1、B2菌株均從某礦山周邊污染土壤中篩選鑒定獲得,SEM如圖1、圖2所示。

1.2 實驗設計

1.2.1 菌株的富集活化及菌液的制備

菌株的富集活化：將用甘油冷凍保存的B1、B2菌懸液于37 ℃水浴鍋中快速融化,平板中劃線涂布培養；挑取單菌落于液體培養基中,160 r/min、30 ℃下振蕩培養1～2 d,再按照1%(體積分數)接種量接種于液體培養基中,同等條件培養1～2 d,得到成熟菌體培養液。

菌液的制備：將培養好的B1、B2菌株用無菌生理鹽水沖洗至滅菌三角瓶中,將菌懸液稀釋至5×108～10×108cfu/g,混勻待用。

1.2.2 單因素培養實驗

根據預實驗,接種B1+B2混合菌對煤矸石肥力強化效果較差,因此本實驗僅探討B1、B2單菌對煤矸石肥力的強化效果。

微生物接種設計，共設置3個接種處理：對照處理,不添加任何微生物,僅加滅菌培養液；B1處理,單接種B1菌株；B2處理,單接種B2菌株。

不同因素的實驗過程設計如下：

(1) 接菌量：將采集的煤矸石晾干、剔除雜質后,磨細過100目尼龍篩,121 ℃高溫滅菌20 min,稱取50.0 g于300 mL錐形瓶中,分別加入25.0、50.0、100.0、150.0 mL B1或B2菌懸液,在體系初始pH=7.00、30 ℃下恒溫培養4 d,以僅加等量滅菌培養液為對照。

(2) 培養時間：稱取30.0 g過篩滅菌煤矸石于300 mL錐形瓶中,分別加入B1、B2菌懸液及滅菌培養液100.0 mL,在體系初始pH=7.00、30 ℃下恒溫培養2、4、6、8、10 d。

(3) 培養溫度：稱取50.0 g過篩滅菌煤矸石于300 mL錐形瓶中,分別加入B1、B2菌懸液及滅菌培養液150.0 mL,體系初始pH=7.00,于20、30、40 ℃下恒溫培養4 d。

(4) 體系初始pH：稱取50.0 g過篩滅菌煤矸石于300 mL錐形瓶中,分別加入B1、B2菌懸液及滅菌培養液150.0 mL,控制體系初始pH分別為6.00、7.00、8.00,30 ℃下恒溫培養6 d。

實驗結束后,參考文獻[13]測定煤矸石pH、有機質、堿解氮、有效磷、速效鉀含量,每個處理設置3個重復。

1.2.3 細菌生長曲線的測定

將B1、B2菌懸液以1%的接種量分別接種到100 mL基礎擴大培養基中,于30 ℃、160 r/min下振蕩培養60 h,每隔30 min取下三角瓶,將菌液倒入比色皿中,在可見分光光度計(EV-2600A)上讀取600 nm處吸光度(OD600),記錄并繪制生長曲線。測定步驟參考文獻[14]。

1.2.4 煤矸石對不同細菌的吸附量測定

100 mL容量瓶中加入50 mL無機鹽液體培養基和0.5 g煤矸石粉末,滅菌后分別接種B1、B2菌懸液2.5 mL,置于30 ℃、160 r/min搖床中培養,分別隔5、15、40、60、120、180、240、300、420、600、780、960 min進行取樣,3 000 r/min離心后棄上清液,重復離心3次。無菌生理鹽水多次清洗下層固體。利用可見分光光度計測定OD600,根據OD600隨時間的變化繪制煤矸石的吸附曲線。

1.2.5 B1、B2菌體及煤矸石表面形貌觀察

B1、B2菌體表面形貌及吸附前后煤矸石表面形貌采用SEM(FEI Inspect F50)觀察,方法參考文獻[15]。

1.2.6 B1、B2菌體及煤矸石Zeta電位測定

采用PALS/90PLUS型Zeta電位儀對B1、B2菌株及煤矸石初始樣品測定Zeta電位。每個樣品自動測定3次,計算平均值。

1.2.7 B1、B2菌體及煤矸石FT-IR分析

利用WQF/520 FT-IR儀對B1、B2菌株及煤矸石初始樣品的表面官能團進行分析。使用KBr壓片制樣,掃描波長為500～4 000 cm-1,步調為1.0 cm-1。

1.2.8 數據處理及統計分析

采用Excel 2018及SPSS 26.0 軟件對數據進行統計分析,采用Origin 2018作圖。

2 結果與分析

2.1 不同影響因素對煤矸石pH和養分含量的影響

2.1.1 接菌量的影響

接菌量對煤矸石養分的影響見表1。實驗組(B1和B2)樣品pH與對照相比總體有所降低,并隨接菌量的增加呈現出逐漸降低的趨勢,其中接菌量為150.0 mL、B1處理樣品pH顯著降低,與對照相比降低了0.61。3種處理下樣品pH總體表現為B1B2>對照。

表1 接菌量對煤矸石pH和養分的影響1)Table 1 Effect of inoculation amount on pH and nutrient of coal gangue

2.1.2 培養時間的影響

培養時間對煤矸石pH和養分的影響見表2。實驗組樣品pH與對照相比均有所降低,并隨培養時間的延長呈現出先降后升的趨勢,其中培養6 d、B1處理樣品pH顯著降低,較對照降低了1.04。3種處理下樣品pH總體表現為B1B2>對照。

2.1.3 培養溫度的影響

培養溫度對煤矸石pH和養分的影響見表3。實驗組樣品pH與對照相比總體有所降低,其中B1處理下樣品pH隨培養溫度的升高呈現出先降后升的趨勢,并在30 ℃達到最低,與對照相比降低了0.41。3種處理下樣品pH均表現為B1B2>對照。

表2 培養時間對煤矸石pH和養分的影響Table 2 Effect of incubation time on pH and nutrient of coal gangue

表3 培養溫度對煤矸石pH和養分含量的影響Table 3 Effect of culture temperature on pH and nutrient content of coal gangue

表4 體系初始pH對煤矸石pH和養分的影響Table 4 Effect of system initial pH on pH and nutrient of coal gangue

2.1.4 體系初始pH的影響

體系初始pH對煤矸石pH和養分的影響見表4。實驗組樣品pH與對照相比總體有所降低,其中B1處理下樣品pH隨培養溫度的升高呈現出先降后升的趨勢,并在體系初始pH=7.00下達到最低,與對照相比降低了0.41。3種處理下樣品pH總體表現為B1B2>對照。

2.2 不同細菌處理煤矸石的機理探究

2.2.1 細菌在液體培養基中的生長特性

不同細菌在液體培養基中的生長曲線如圖3所示。B1菌株在液體培養基中0～10 h生長遲緩；10 h后進入對數生長期,活菌數呈現對數上升,生長快速；20～30 h生長平穩,此期間細菌數量處于動態平衡；35 h后進入衰亡期,死菌數量超過活菌,活菌數量呈下降趨勢。B2菌株0～8 h處于遲緩期,8 h后進入對數生長期,20～40 h處于穩定期,40 h后進入衰亡期。可見,B1、B2菌株的生長速度較快,可用于改善煤矸石養分含量。

2.2.2 煤矸石對細菌的吸附量

隨吸附時間的延長,兩株細菌的OD600均先升后降,但趨勢略有不同(見圖4)。在5～420 min,B1菌株OD600由0.016升至0.247,B2菌株OD600由0.008升至0.236,說明煤矸石吸附的細菌量在不斷增加；當吸附時間超過420 min后,兩株細菌的OD600均下降,表示此時煤矸石中的細菌量開始減少。此外,除在240～300 min時段B2菌株的吸附量高于B1外,煤矸石對B1菌株的吸附量整體高于B2,且最佳吸附時間約為420 min。

為進一步驗證細菌與煤矸石表面吸附的微形貌,采集吸附前后的煤矸石樣品進行SEM生物樣品制備,結果見圖5。與對照相比,B1和B2菌株吸附于煤矸石表面。

2.2.3 細菌的Zeta電位

在體系初始pH=7.00的條件下,B1、B2菌株及煤矸石樣品的Zeta電位分別為-10.26、-11.93、-25.80 mV。通過計算B1、B2菌株與煤矸石樣品的電位差可知,相較于B2菌株,B1菌株攜帶相對較少的負電荷,與煤矸石的電位差更大,即更易吸附于樣品表面,這可能是由于B1菌株表面具有更高的胞外聚合物和蛋白質含量,從而使其具有更高的等電位點[16],從而具有較高的Zeta電位。

2.2.4 FT-IR分析

為進一步探究兩株解磷細菌對煤矸石肥力強化效果差異,對B1、B2菌株及煤矸石樣品分別進行FT-IR分析,在細胞水平上獲取相關結構信息,結果見圖6。B1、B2菌株蛋白質的酰胺Ⅰ帶和Ⅲ帶中均存在大量的C=O、N-H等官能團,能通過靜電作用和配位作用等方式與金屬離子結合,而煤矸石中鋁離子和鐵離子是容易發生配位作用和靜電吸附的金屬離子。B1、B2菌株容易通過靜電吸附和配位作用與煤矸石中金屬離子產生吸附。其中,2 965 cm-1處B2菌株代表官能團C-H鍵產生伸縮振動。由于C-H鍵的強度較大,且C和H的電負性相差很小,導致C-H極性很小,屬于弱電極性[17]。因此,B2菌株的穩定性強于B1,即B1菌株的吸附能力強于B2,能更好地吸附在煤矸石表面。這與2.2.2、2.2.3節結果相符合。

3 討 論

3.1 影響因素對煤矸石pH和養分含量的影響

本研究表明,接種微生物能有效改善煤矸石基本理化性質,尤其顯著提高煤矸石有效磷含量、降低其pH,這與趙陟峰[18]利用外源微生物改良煤矸石的研究結果相符合。根據解磷細菌的溶磷機理,pH和有效磷含量的變化是衡量細菌解磷能力強弱的重要指標[19]。pH是菌種生長的化學因子,對微生物生長有較大影響。適宜的pH有利于提高溶磷效率[20],pH過高或過低會對基質肥力和植物生長產生負面影響。解磷細菌代謝產生的有機酸能通過與礦物表面的陽離子形成復合物來提高磷的有效性。有機質是煤矸石基質中各種營養元素特別是氮、磷的重要來源,是衡量煤矸石肥力高低的重要指標[21]。在較短實驗周期內,實驗組煤矸石有機質含量均有不同程度增加,可能是由于外源微生物大量介入,導致外源或煤矸石中微生物部分死亡,從而增加了煤矸石有機質含量[22]。也可能是因為接種外源微生物能促進煤矸石形成穩定團聚體,從而減少其有機質流失。馮廣達[11]12-15在測定煤矸石對磷的吸附特征時發現,與土壤相比,煤矸石對磷的吸附性強、解吸率低、生物有效性差。因此,煤矸石生態修復時應調節其pH并增加有機質含量,促進生態恢復。

接菌量是與煤矸石肥力直接相關的影響因素。較大接菌量盡管可使細菌在煤矸石中生長迅速,但后期可能因缺乏營養導致細菌生長緩慢甚至死亡,而接菌量太低可能使煤矸石營養利用不充分并導致培養周期延長,感染雜菌概率增大。隨著接菌量的不斷增加,煤矸石養分含量持續增加,pH逐漸降低,說明接菌量對實驗結果影響較大,這與袁向芬等[23]的研究結果相一致。就培養時間而言,當培養時間超過6 d時,煤矸石中堿解氮和有機質的含量呈下降趨勢,pH反而升高,這可能與細菌自身生長周期有關。培養周期超過6 d,細菌早已進入衰亡期,導致堿解氮、有機質含量降低；菌液失活,細菌呼吸作用減弱,不再分泌有機酸、釋放CO2,導致pH逐漸升高[24]。總之,這可能與細菌復雜的生長代謝過程及營養缺失有關[25]。研究結果表明,30 ℃的培養環境較20、40 ℃時好,可見B1和B2菌株的最適生長溫度為30 ℃,培養溫度過高或過低均會影響細菌的生長。該培養溫度條件與蘇輝蘭等[26]、陳炫等[27]關于解磷細菌的最適生長溫度結果一致。B1和B2菌株在體系初始pH=7.00下更適宜生長,活性較高,能更好地吸附在煤矸石表面,該結果與王美鑫等[28]在NBRIY培養基中培養解磷細菌CoPDB4的最適生長pH相符合。

3.2 不同細菌對煤矸石肥力的強化效果

決定微生物對煤矸石肥力強化效果的影響因素包括煤矸石性質、微生物性質和環境要素[29]。因此,在分析環境要素(接菌量、培養時間、培養溫度、體系初始pH)的基礎上,從煤矸石及微生物性質層面探究B1、B2菌株與煤矸石之間的作用機制。不同影響因素、3種處理下煤矸石pH的影響總體表現為B1B2>對照。吸附實驗及SEM表明,兩株細菌主要吸附于煤矸石表面,并隨著吸附時間的延長呈現出先升后降的趨勢,且總體上B1菌株的吸附量高于B2。細菌對煤矸石的吸附作用是在煤矸石表面發生的,因此煤矸石表面性質對吸附作用有著極其重要的影響[30]。YANG等[31]研究表明,若微生物和礦物的表面電性有助于微生物吸附,則微生物必定可吸附于礦物表面。Zeta電位結果表明,在體系初始pH=7.00的前提下B1菌株與煤矸石的電位差高于B2,更有效地吸附于煤矸石表面。FT-IR分析表明,在細胞層面上B2菌株的穩定性強于B1,所以吸附性低于B1,這與吸附實驗、Zeta電位結果相符合。因此,可從煤矸石和微生物性質層面得出B1菌株的解磷效果優于B2。

4 結 論

(1) 相較于對照,實驗組樣品pH有效降低,有效磷、速效鉀、堿解氮、有機質含量均得到不同程度的提高,說明接種微生物可改善煤矸石養分含量,煤矸石的肥力提高。

(2) 相同條件下,3種處理的影響效果總體表現為B1>B2>對照。通過吸附實驗及SEM、Zeta電位、FT-IR表征手段分析作用機理得出,B1菌株對煤矸石的處理效果優于B2。

(3) 通過比選,接菌量為150.0 mL、培養6 d、體系初始pH=7.00、培養溫度為30 ℃,B1處理下煤矸石養分提升最明顯,有效磷、速效鉀、堿解氮、有機質含量較對照顯著提高了4.98、1.17、1.16、0.32倍,pH降低了0.41。