生物發酵麥麩脫除赭曲霉毒素A的條件優化及發酵前后揮發性風味物質的評價

鄒 東，楊 陽，黃鶴陽，紀 劍，孫秀蘭

（江南大學食品學院，江蘇無錫 214122）

赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）主要是由曲霉菌產生的一種有毒次級代謝產物，廣泛存在于各種食品和飼料中，如谷物和谷物制品、干果、葡萄、奶酪和肉制品等，嚴重威脅人和動物的健康安全。OTA分子式為CHClNO，多種研究表明OTA不僅具有腎毒性，還具有肝毒性、致畸性、遺傳毒性和致癌性，現已被國際癌癥研究機構歸類為2B類致癌物。不同食品中的OTA含量都具有相應的限量標準，歐盟規定谷物原料最大限量5 μg/kg，谷物加工制品最大限量3 μg/kg，嬰幼兒及特醫性食品不超過5 μg/kg，對于葡萄干、可溶性咖啡和一些干果的最大允許限值為10.0 ng/g。聯合國糧農組織和世界衛生組織暫定OTA對人體的每周容許攝入量為100 ng/kg。我國對配合飼料中的OTA最高限量為100 μg/kg。據報道，植物源性食品中OTA的平均濃度在0.1～100 ng/g之間。由小麥、燕麥、大麥、黑麥等谷物制成的食品及干草/青貯飼料也含有0.1～100 ng/g的OTA，在動物源性食品和飼料中，OTA的水平在0.1～1 ng/g之間。因此，研究OTA的脫毒不可或缺。食品和飼料中的霉菌毒素的方法通常分為物理、化學和生物三種方法。物理和化學方法存在能源消耗大，脫毒過程會對產品造成營養成分的流失，產生各種副產物等缺點，相較于這兩種方法，生物法具有可持續性、環保、安全等優勢。

麥麩即小麥皮，是優良的氨基酸源，并含有多種礦物質及微量元素。目前，我國小麥麩皮年產量大，最高可達2000萬噸，在傳統的農業生產中多用于牲畜飼料、食品和藥品的加工應用。但麥麩中真菌毒素污染嚴重，其中包括OTA，限制了其在飼料工業中的安全應用。生物發酵麥麩的研究早有報道，發酵后的麥麩營養特性明顯提高，還能產生多種有益的生物活性物質，提高飼料的飼用品質。陳洪偉等的研究表明，黑曲霉和酵母菌協同發酵麥麩可以提高其粗蛋白及游離氨基酸含量。同多數麥麩發酵的研究一樣，該研究進行了微生物發酵麥麩的營養物質評價，但缺少對麥麩發酵前后真菌毒素及風味物質的變化的研究。黑曲霉降解真菌毒素的有效性及發酵飼料降解真菌毒素的研究此前已有報道，黑曲霉也被證實對OTA具有降解作用，然而降解過程均在培養基體系中進行，應用在實際樣品中的研究較少。

因此，本研究使用本課題組篩選的一株非產毒黑曲霉菌株FS-UV-21，生物發酵OTA污染的麥麩，采用響應面法優化發酵條件，并對最優發酵條件下麥麩發酵前后的揮發性風味物質的變化進行分析。該研究旨在為麥麩資源的安全應用及深度開發提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑曲霉FS-UV-21 由本課題組篩選并保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCC No.20751；麥麩 河北五得利面粉集團有限公司；OTA標準品 純度≥99%，美國默克公司；乙腈、無水乙酸 色譜純，上海國藥集團化學試劑有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA培養基）上海博微生物科技有限公司。

Agilent 1260 HPLC系統 美國安捷倫公司；GI54DWS 型高壓滅菌鍋 美國ZEALWAY產品；BSC-1300Ⅱ型超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司產品；PHY-DHS*500-BS型恒溫培養箱 上海博泰實驗設備有限公司產品；PB303型電子精密天平 上海梅特勒-托利多儀器有限公司；EX-OHOUS型旋渦振蕩儀 美國奧豪斯公司產品；Scientz-10N型臺式冷凍干燥機、Scientz-10LS型真空離心濃縮儀 寧波新芝生物科技股份有限公司產品

1.2 實驗方法

1.2.1 黑曲霉FS-UV-21菌株活化及孢子懸浮液制備 將黑曲霉FS-UV-21從-80 ℃取出，接種于PDA培養基上，在28 ℃恒溫培養7 d，再用滅菌后的生理鹽水（含0.05%的吐溫-80）將洗下黑曲霉孢子作為孢子懸液，并調整濃度至10CFU/mL，備用。

1.2.2 生物發酵法處理麥麩 將麥麩粉碎，過40目篩后收集備用。對粉碎后的麥麩進行采樣稱重，采樣方法參考GB/T 14699.1-2005，精準稱取10 g樣品置于250 mL三角錐形瓶中，封口膜封口后置于滅菌鍋（121 ℃，20 min）中滅菌。

滅菌處理后待麥麩冷卻至室溫后，分別加入無菌水（含OTA標準品）和FS-UV-21孢子懸液，攪拌均勻，麥麩中OTA終含量為1 μg/g。恒溫有氧發酵，取樣待檢測。對滅菌后的麥麩及加標后的麥麩進行取樣檢測，確定OTA的加標回收率。

1.2.3 麥麩中OTA的測定 參考GB 5009.96-2016對麥麩中OTA進行提取和檢測。配置OTA標準溶液：質量濃度梯度為 10、25、50、100、250、500、1000、2000 ng/mL。

液相色譜條件優化，條件如下：使用C反相柱（Thermo Hypersil Gold C，150 mm×4.6 mm，3.5 μm）和熒光檢測器（FLD，=333 nm 和=460 nm；增益=100），通過HPLC分析提取物。進樣量為20 μL，樣品以1 mL/min的流速洗脫，流動相為乙腈/水/乙酸的混合物（99:99:2，V/V/V），柱溫為 30 ℃，洗脫時間為15 min。

1.2.4 單因素實驗設計 FS-UV-21孢子懸液濃度固定為10CFU/mL，分別探究料水比（麥麩質量與無菌水體積的比值，g/mL）、接種量（孢子懸液體積與麥麩質量的百分比，%）、溫度（麥麩發酵溫度，℃）及時間（麥麩發酵時間，d）等因素對OTA脫除率的影響，試驗設計如下：接種量分別為1%、5%、10%、15%、20%，發酵溫度 30 ℃，發酵時間 4 d，料水比為1:3 g/mL；發酵溫度為 20、25、30、35、40 ℃，接種量為10%，發酵時間4 d，料水比為1:3 g/mL；發酵時間為 2、3、4、5、6 d，接種量為 10%，發酵溫度30 ℃，料水比為 1:3 g/mL；料水比為 1:1、1:2、1:3、1:4、1:5 g/mL，接種量為 10%，發酵溫度 30 ℃，發酵時間4 d。分別進行實驗，檢測麥麩中OTA的脫除率。

OTA脫除率計算方法為：OTA脫除率（%）=（未發酵樣品中OTA含量-發酵后樣品中OTA含量）/未發酵樣品中OTA含量×100

1.2.5 響應面法因素水平試驗設計 參考上述單因素實驗的結果，應用Box-Behnken設計方法和響應面處理軟件，選擇接種量（A）、發酵溫度（B）、發酵時間（C）、料水比（D）作為響應變量，設計四因素三水平試驗，以OTA脫除率作為響應值進行響應面優化設計。響應面試驗因素與水平設計見表1。

表1 響應面試驗因素與水平設計Table 1 Factors and levels of response surface test

1.2.6 麥麩生物發酵前后揮發性物質檢測 利用頂空固相微萃取風味物質。取5 g接種發酵后的麥麩樣品置于40 mL頂空進樣瓶中密封，將頂空進樣瓶置于加入加熱裝置中30 min，再將萃取頭插入瓶中，距離1 cm處進行萃取，萃取后立即進樣。萃取溫度為50 ℃，萃取時間為30 min，解析時間為5 min。

采用氣質聯用檢測風味物質，色譜毛細管柱為Equity-5柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm），使用以下溫度程序：主烤箱溫度范圍從40～140 ℃，以10 ℃/min升溫，然后到200 ℃，以7 ℃/min升溫，進樣口溫度為250 ℃。載氣為氦氣，流速為2.5 mL/min，無分流。電離方式為EI，電子能量為70 eV，檢測器電壓為-1499 V，m/z范圍為15～350。使用自動數據處理軟件Chroma TOFFi （LECO）以200的信噪比閾值處理總離子色譜圖。

1.3 數據處理

GraphPad Prism 8.0、SPSS 26、Design Expert11軟件用于數據的統計分析。數值顯示為三個實驗的平均值±SD，每個實驗進行三次。

2 結果與分析

2.1 麥麩中OTA的提取

提取加標前后麥麩中OTA的實驗結果如表2所示，加標前麥麩中未檢測出OTA。加標后的麥麩中OTA含量理論上為1 μg/g，實際檢測結果顯示加標麥麩中OTA含量平均為0.9878 μg/g，表明OTA的加標回收率較好。

表2 麥麩中OTA的含量Table 2 OTA content in wheat bran

2.2 單因素實驗

2.2.1 接種量對OTA脫除的影響 由圖1可見，黑曲霉FS-UV-21的接種量對麥麩中OTA的脫除率有顯著影響（＜0.05）。在接種量為15%時，OTA的脫除率最高，在接種量為1%～15%的區間內，OTA的脫除率都隨著接種量的增加而升高。然而接種量為20%時，OTA的脫除率明顯降低，說明接種量過大或過小都不利于麥麩中OTA的生物脫除。接種量過小時，發酵體系內黑曲霉較少，會延長發酵周期，而接種量過大時，黑曲霉菌之間生存競爭加大，很可能導致菌株在發酵體系中的生長受抑制。因此，接種量的選擇應在15%左右。

圖1 接種量對黑曲霉脫除OTA的影響Fig.1 Effect of inoculation amount on the removal of OTA by Aspergillus niger

2.2.2 發酵溫度對OTA脫除的影響 溫度對黑曲霉的生長及代謝產生極大的影響，在不同的發酵體系中，黑曲霉的最適發酵溫度不一定相同。因此，試驗研究了在麥麩發酵體系中不同發酵溫度對黑曲霉脫除OTA的影響。根據圖2可知，在20～30 ℃的溫度區間內，OTA的脫除率隨溫度的提高而升高，在30 ℃時脫除率最高為51.71%。當溫度超過30 ℃，黑曲霉的脫除能力明顯降低，很可能偏離了黑曲霉的最適生長溫度，影響了發酵體系內微生物的生長，無法形成良好的酶系，也可能黑曲霉內轉化OTA的酶活性被抑制，導致OTA脫除率的降低。因此，選擇30 ℃左右為麥麩體系的響應面優化水平。

圖2 發酵溫度對黑曲霉脫除OTA的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on the removal of OTA by Aspergillus niger

2.2.3 發酵時間對OTA脫除的影響 微生物的生長及生理活性與培養時間密切相關，因此微生物發酵體系內，發酵時間也是需要控制的重要因素之一。在其他條件不變的情況下，從圖3可以看出OTA的脫除率隨著發酵時間的增加而升高，在第5 d時脫除率為59.74%，第6 d的OTA脫除率（59.85%）與第5 d相比無顯著增加（＞0.05）。因此，選擇發酵時間為5 d左右。

圖3 發酵時間對黑曲霉脫除OTA的影響Fig.3 Effect of fermentation time on the removal of OTA by Aspergillus niger

2.2.4 料水比對OTA脫除的影響 發酵過程中，體系含水量也是菌體正常生長發育的關鍵因素之一。如果含水量過低，微生物沒有足夠可利用的水進行生理活動；而含水量過高則會導致傳質和傳氧困難。因此，適宜的料水比對麥麩中OTA的脫除也至關重要。由圖4可知，隨著水含量的增加，OTA的脫除率先升高后下降，料水比為1:3 g/mL時脫除率最高為51.43%。故選取1:3 g/mL作為0水平進行響應面試驗。

圖4 料水比對黑曲霉脫除OTA的影響Fig.4 Effect of ratio of material to water on the removal of OTA by Aspergillus niger

2.3 響應面試驗結果

2.3.1 響應面試驗設計因素與水平 根據上述單因素實驗結果，可以得到接種量、料水比、發酵時間、發酵溫度四個因素的較優水平，采用響應面法對四個因素三水平進行試驗設計，各因素兩兩交互影響。以OTA脫除率為指標，最終得到黑曲霉發酵脫除麥麩中OTA的最佳條件。響應面試驗設計及結果見表3。

表3 響應面試驗設計及結果Table 3 Response surface test design and results

2.3.2 響應面回歸模型的建立與分析 利用Design Expert 11對響應面實驗結果進行分析，可以得到以OTA 脫除率（Y）為響應值，接種量（A）、發酵溫度（B）、發酵時間（C）、料水比（D）的二次多項回歸模型：

Y=57.5760+0.3542A+3.5483B-0.1842C+0.9317D-0.0450AB-0.5125AC-1.2450AD-1.5750BC+3.6400 BD+0.5200CD-3.1405A-7.879B-2.7605C-3.6692 D2

為了檢驗回歸模型的有效性和可靠性，回歸模型的方差和顯著性分析結果見表4。

結果表明，回歸模型高度顯著（＜0.01），失擬項不顯著（＞0.05），為 0.8531，表明該模型擬合性較好，可較好的預測分析并能夠反映各因素水平與響應值之間的關系。因此，由表4可知，試驗影響因素的主次排序如下：發酵溫度＞料水比＞接種量＞發酵時間。

表4 OTA脫除率回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of OTA removal rate regression model

2.3.3 各因素兩兩交互作用 黑曲霉發酵麥麩脫除OTA的4個影響因素：接種量（A）、發酵溫度（B）、發酵時間（C）、料水比（D）兩兩交互作用對麥麩中OTA脫除率影響的響應面圖見圖5。

圖5 各因素交互作用對OTA脫除率影響的響應面圖Fig.5 Response surface plots of the interaction of various factors on the removal rate of OTA

結合上述結果，交互項BD即發酵溫度與料水比的交互作用顯著（＜0.05），而交互項 AB、AC、AD、BC、CD的試驗結果顯著性分析為＞0.05，表明其他交互項之間交互作用不顯著。該響應面模型存在最高點，即平面等高線圖的圓心，表明在此條件下OTA的脫除效果較好。

2.3.4 響應面最優條件的確定 通過上述分析得優化因素為接種量15.05%，發酵溫度31.48 °C，發酵時間4.91 d，料水比1:3.27 g/mL。此條件下預測的OTA脫除率為58.24%。考慮到實際實驗的操作性和可行性，選取接種量15%，發酵溫度32 °C，發酵時間5 d，料水比1:3.3 g/mL進行發酵麥麩實驗，得到OTA脫除率為60.89%±0.93%，與理論值相對誤差為2.65%，說明該條件優化參數可行，可用于實際應用中。

2.4 最優發酵參數下麥麩中揮發性風味物質分析評價

對黑曲霉發酵前后麥麩中的揮發性風味物質進行研究。發酵前后總離子流色譜圖如圖6，黑曲霉發酵處理后的麥麩揮發性物質變化明顯。本實驗在發酵前后共鑒定出揮發性成分398種，其中酚類24種，醇類84種，醛類42種，酯類116種，雜環類24種，苯環類65種及其他（圖7）。

圖6 麥麩發酵前后總離子流色譜圖Fig.6 Total ion flow chromatogram of wheat bran before and after fermentation

圖7 發酵前后麥麩揮發性風味物質種類與數量Fig.7 Types and quantities of volatile flavor compounds in wheat bran before and after fermentation

對比發酵前的麥麩，結合T檢驗得到的值和FC值繪制整體揮發性物質的火山圖。如圖8 A所示，橫坐標為log 2的FC值，縱坐標為-log 10的值，使用log轉換縮小差異過大或過小的揮發性物質之間的差異。選取＜0.05，log 2（FC）＞1 或＜-1篩選顯著差異物質，藍色表示顯著下調物質，紅色表示顯著上調物質。發酵后的麥麩揮發性化合物上調了207種，下調了191種8，其中上調最多的壬醇，下調較大的為-萜品烯（圖8 B）。壬醇具有玫瑰和橙的香氣，是我國GB 2760-86規定為允許使用的食用香料，主要用于本制奶油、桃、橙、檸檬、白檸檬和菠蘿等型香精，而-萜品烯則具有柑橘和檸檬似香氣，主要用以配制人造檸檬和薄荷精油。所以，黑曲霉發酵后會改變麥麩原有的氣味，除此之外，還有許多帶有愉快香氣的揮發性物質在發酵后產生，如對茴香醛、己酸、-壬內酯、-十一內酯、6-甲-5-庚烯-2-酮等，這些物質可以改善麥麩的風味，以增加動物飼料的適口性。

圖8 發酵前后麥麩揮發性風味物質對比分析Fig.8 Comparative analysis of volatile flavor substances in wheat bran before and after fermentation

發酵后麥麩揮發性物質中占比最大的物質為醇類、酯類與苯環類。表5列舉出了一些麥麩發酵前后相對含量變化較大的物質。麥麩發酵前相對含量較多的3-辛酮、3-辛醇和辛烯-3-醇在發酵后含量明顯減少。也有許多揮發性物質相對含量升高了。其中香蘭素具有香莢蘭豆香氣及濃郁的奶香，起增香和定香作用，且香氣穩定，可為發酵后的麥麩增添獨特的香氣。

表5 發酵前后麥麩中揮發性物質的相對含量Table 5 Relative content of volatile substances in wheat bran before and after fermentation

3 結論

本研究利用黑曲霉FS-UV-21生物發酵麥麩，研究了發酵中的關鍵因素（接種量、發酵溫度、發酵時間、料水比）對麥麩中OTA脫除率的影響。并運用響應面法優化上述四個因素，得到最優脫除條件為接種量 15%，發酵溫度 32 °C，發酵時間 5 d，料水比1:3.3 g/mL，脫除率為60.89%。并對發酵后的麥麩揮發性風味物質進行研究分析，發現發酵后的麥麩風味物質明顯增多，并且不同于傳統麥麩風味的揮發性化合物含量增加明顯，如壬醇、香蘭素等，均可賦予發酵麥麩愉悅的風味。因此，黑曲霉FS-UV-21發酵麥麩不僅能有效降低其中OTA的含量，還能提升麥麩的風味，提高麥麩的利用價值。后續還可在此基礎上研究黑曲霉發酵的安全性及其降解其他霉菌毒素的可能性，為發酵麥麩將來的綠色健康生產應用提供參考。