丹參酮提取物對奶牛乳腺炎常見致病菌抑菌試驗

陶 蕾，王廣宇，王明彥，陳彥亮，樊志強，郭 杰，梁 妍，高寶山

（1.蘭州市職業技術學院，蘭州 730070；2.三門峽廣宇生物制藥有限公司，河南 三門峽 472400；3.河南省中藥材生產技術推廣中心，鄭州 450000；4.蘭州大學，蘭州 730070；5.天津市武清區農村社會事業發展服務中心，天津 301700）

丹參是中醫的一味常用中藥，在植物分型中屬于唇形科鼠尾草屬范圍，生長地方較為廣泛，而在我國，盛產丹參的省份主要有河南、山西、河北等地[1]。丹參作為一種活血化瘀類藥物被廣泛應用，近年來也得到了國外的認可[2]，成功進入《美國藥典》[3]。而丹參酮是丹參中提取出來的活性成分，該類成分具有較強的抑制金黃色葡萄球菌功效，如耐藥金黃色葡萄球菌[4]。在奶牛養殖業發展期間，奶牛發乳腺炎的問題是最為常見的問題，奶牛乳腺炎的發生原因較多，而最為常見的致病因素則為物理因素及各種細菌、微生物，這些因素會在一定程度上刺激到奶牛的乳腺，進而逐步發展成為炎癥病變，尤其是細菌、病原微生物感染等，目前，國內外應用抗生素是奶牛乳腺炎治療的最有效辦法。但隨著抗生素的大量應用，耐藥性不斷產生，嚴重影響了療效，同時，抗生素的使用會導致牛奶中蓄積藥物，還會對奶牛造成腸道菌群失調。而通過中藥有效成分能夠克服抗生素治療中的弊端，通過篩選抑菌作用強、對環境穩定的中藥有效成分來防治奶牛乳腺炎，是綠色防控奶牛乳腺炎的一個重要課題。通過體外抑菌試驗篩查各種有效成分，從而確定有效成分，為進一步研制新獸藥打下基礎。

1 材料

1.1 供試藥物

丹參酮提取物（隱丹參酮含量3%，丹參酮ⅡA 11%），三門峽廣宇生物制藥有限公司生產。

1.2 菌株

無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）、乳房鏈球菌（Streptococcus uberis）、從乳腺炎患牛乳汁中分離鑒定的菌株。

枯 草 芽 孢 桿 菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]、停乳鏈球菌（Streptococcus dysgalactiae）[ATCC 35666]、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]、大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]、變形桿菌（Proteusbacillus vulgaris）[CMCC（B）49027]、化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes）[ATCC 19615]、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CICC 10419]，其來源為中國工業微生物菌種保藏與管理中心、中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.3 培養基

①MH營養肉湯；②依據無菌檢查法配制的無菌生理鹽水；③營養瓊脂培養基；④MH營養瓊脂；⑤營養肉湯培養基；⑥麥康凱瓊脂培養基，以上各種材料均購置于廣東環凱微生物科技；LB Broth（Lennox，SIGMA）；北京索萊寶（Solarbio）科技提供的無菌脫纖維綿羊血。所用試劑均為分析純。

1.4 儀器與設備

本次所用儀器設備包含：①DW-86L338型立式超低溫保存箱；②HPsafe-1200LC型生物安全柜；③麥氏比濁管；④GHP-9160型隔水式培養箱；⑤LDZX-30KBS型立式壓力蒸汽滅菌器⑥HZP-250型全溫振蕩培養箱；⑦MX-S型漩渦混合；⑧DHG-9240A型電熱鼓風干燥箱。

2 方法

2.1 最小抑菌濃度MIC值的測定

最小抑菌濃度MIC值的測定[5-6]：測定方法為常量稀釋法，由經驗豐富的醫師開展操作，操作期間按照標準操作規范對實驗菌株進行測定，通過管碟法觀察其體外抑菌活性[7-8]。稀釋液為MH肉湯（Mueller-Hinton Broth）。

2.2 接種菌量的準備

取各菌（細菌）的肉湯培養物先進行稀釋處理，稀釋的標準為10倍，完成以上操作后進行MH肉湯稀釋，直至達到含菌量為1×107cfu/mL范圍為止，并將以上培養物放于標準環境以備檢測。

2.3 試管二倍稀釋法聯合瓊脂平板法

在開展這一項試驗過程中為了確保更加準確的成功率和詳細的試驗數據，應用2組對照的方式進行，2組的稀釋方法一樣，選取22支規格大小為5 mL的無菌離心管平均分為2組，各組留存1#管，其他的離心管分別將2 mL的MH肉湯加入，鏈球菌的方式為添加2%的小牛血清的MH肉湯，在研究組1#管、2#管中分別加入丹參酮提取物配置的原液，添加的劑量為2 mL，之后記錄1#管為抗菌藥物原液，并確保1#管的質量濃度為500 mg·mL-1。將2#管中的營養肉湯中加入丹參酮提取物，輕輕搖晃使其均勻后吸取2 ml混合液推注到3#管，按照這種方式持續對藥液進行稀釋，一直到10#管抽吸2 mL，并將其他離心管丟棄，完成以上操作之后，進行對照藥液組中的11#管則屬于無藥液管。1#管中的藥物質量濃度為500 mg·mL-1、2#管中的藥物質量濃度為250 mg·mL-1、3#管中的藥物質量濃度為125 mg·mL-1、4#管中的藥物質量濃度為62.5 mg·mL-1、5#管中的藥物質量濃度為31.25 mg·mL-1、6#管中的藥物質量濃度為15.625 mg·mL-1、7#管中的藥物質量濃度為7.81 mg·mL-1、8#管中的藥物質量濃度為2.91 mg·mL-1、9#管中的藥物質量濃度為1.95 mg·mL-1、10#管中的藥物質量濃度為0.98 mg·mL-1。

2.4 接種

研究組1#管至11#管中控制加入的稀釋菌液為每次100 μL，而參考組的各離心管則不添加稀釋的菌液。完成稀釋操作之后將菌液放于37℃恒溫的培養箱中進行孵育，孵育時間為21 h左右。并對比分析2組藥物濃度相等的離心管，并作為初步判定結果，如果離心管內的溶液顯示為渾濁狀態表示存在細菌生長，如果離心管的溶液表現為清澈透明，則判定為離心管內溶液沒有出現生長的細菌，轉種將試驗組與對照組各管內的中藥與細菌的培養物，劃線接種至血瓊脂平板，放置在37℃恒溫的培養箱中孵育22 h左右。

2.5 結果判定

由試驗者詳細地對血瓊脂平板上是否出現細菌生長進行觀察和記錄，本次受試丹參酮提取物對該菌的最低抑菌濃度判定標準為：血瓊脂平板上沒有出現生長細菌的離心管，并將以上的各菌重復3次，最終的平均值為最終測定水平。

2.6 管碟法

本次抑菌活性的測定方法為體外抑菌法[9-10]。詳細的測定方法主要分為以下3個步驟：（1）準備好培養基平板，依據商品操作說明書規范配置水解酪蛋白瓊脂培養基，在121℃的高溫下滅菌15 min，直至溫度下降到55℃左右，將其傾注無菌平皿，從而保持瓊脂厚度4 mm。應用5%的脫纖維綿羊血的MH瓊脂平板孵育鏈球菌。水解酪蛋白瓊脂平板使用前應置35℃孵育30 min，試驗人員應對其表面進行詳細檢查，查看是否處于干燥狀態，避免由于表面潮濕影響試驗結果；

（2）確定最佳涂布濃度：具體的方法是通過用營養肉湯（細菌）進行稀釋處理，稀釋的范圍標準為各活化菌液10-1～10-5的10倍遞增方法，完成稀釋處理以后將其放置在37℃的環境中培養22 h左右，之后檢測人員詳細觀察菌苔生長狀況，并由此測得最合適的菌類涂布濃度；

（3）牛津杯加注丹參酮提取物藥液法：檢測人員應用生理鹽水稀釋制備的菌液，稀釋的標準為涂布濃度，然后進行MH瓊脂平板涂抹和接種操作，平板加蓋置放于超凈工作臺內，干燥3 min以上，最長時間為15 min，并依次完成酒精燈微灼、瓊脂與受試丹參酮提取物藥液原液混合等操作。應在此期間將2張滅菌濾紙覆蓋于牛津杯上，將杯蓋合上，水平放置平皿，在37℃恒溫培養箱中孵育22 h左右，并對試驗結果進行觀察。如果抑菌環直徑在10 mm以內則判定結果為沒有抑菌效果，如果超過10 mm而低于15 mm則表示存在較弱的抑菌效果，超過15 mm并低于22 mm則判定為中等的抑菌效果，如果超過22mm則表示抑菌效果強。

3 結果與分析

丹參酮提取物的最小抑菌濃度（MIC）及抑菌強度結果觀察，見表1。

表1 丹參酮提取物最低抑菌濃度及抑菌圈直徑結果

通過以上結果可以看出，丹參酮提取物對不同細菌的抑菌效果存在差異，抑菌效果最強的為鏈球菌屬&枯草芽孢桿菌，其次屬于金黃色葡萄球菌，抑菌效果處于中等范圍，抑菌效果相對較差的為腸桿菌。

牛津杯加注丹參酮提取物藥液的體外抑菌法結果與試管二倍稀釋法結果相一致，丹參酮提取物（500 mg·mL-1）對各種菌均有較好的抑菌效果，其中對鏈球菌屬和枯草芽孢桿菌具有較強的抑菌效果，抑菌圈直徑介于22.5～25 mm區間；對腸桿菌的抑菌強度最低，抑菌圈直徑在20.0～22.0 mm之間。抑菌強度大小依次為：鏈球菌屬&枯草芽孢桿菌＞金黃色葡萄球菌＞腸桿菌。

4 討論

中藥具有一定的抑菌效果，藥物成分不同、藥物搭配方式不同也會產生不同的效果[5]，與抗生素等西藥相比，中醫的毒性更低，且長時間使用一般也不會產生抗藥性，優勢較多。丹參酮提取物是中醫常用的補血補氣藥物，在奶牛乳腺炎治療中也同樣能夠發揮良好的活血化瘀、補血補氣功效，進而使奶牛乳腺炎病情得以改善、奶牛的機體免疫力得以提升。本次體外抑菌試驗研究中，丹參酮提取物具備很強的抑制鏈球菌屬和枯草芽孢桿菌功效，其檢測所得的最低抑菌質量濃度值均在125 mg·mL-1以內，同時還具備一定抑制一般致病性腸桿菌和金黃色葡萄球菌的功效，抑菌效果最強的為鏈球菌屬&枯草芽孢桿菌，其次屬于金黃色葡萄球菌，抑菌效果處于中等范圍，抑菌效果相對較差的為腸桿菌。

本次試驗中，丹參酮提取物的抗菌活性與抗生素有一定差距，丹參酮提取物抑菌抗菌作用弱于抗生素的原因可能與本次測試期間的培養基狀態及所選取的細菌含量和狀態等因素有著密切的聯系，造成本次試驗結果中的抑菌作用效果不明顯。

綜上所述，丹參酮提取物作為一種純中藥制劑，優勢眾多，藥物生產流程較為簡單，可降低藥物成本，并減少了使用期間的不良反應，對于多種細菌均可產生良好的抑制效果，具有很大的開發價值。該藥物還可以與抗生素搭配使用，從而使藥物之間互相協同，提高藥物治療效果，宜積極推廣。