中華蚊母樹在干旱-水淹交叉脅迫下形態和活性氧代謝的適應機制

李曉玲，楊 進，孫 雷,，黃應平，朱士江，呂 坤,，胥 燾,，黃桂云，張國禹

1 三峽庫區生態環境教育部工程研究中心，湖北省三峽地區生態保護與治理國際聯合研究中心, 宜昌 443002 2 三峽大學生物與制藥學院，宜昌 443002 3 中國長江三峽集團有限公司長江珍稀植物研究所，宜昌 443000

隨著全球氣候變暖,植物應對干旱和水淹脅迫的生理生態適應機制引起了生態學者的廣泛關注[1—2]。由于三峽大壩的修建,形成了水位落差將近30m、面積達349km2的季節性漲落的消落帶[3]。同時,三峽庫區夏季暴雨洪水和高溫干旱頻發,促使水位變化頻率加快,導致部分消落帶在短期內形成水淹和干旱交叉脅迫現象[4]。這種大幅度、高頻次的水位漲落將嚴重影響三峽庫區的安全、健康和可持續發展[5]。因此,深入研究植物對干旱-水淹交叉脅迫下的特異性生理生態適應機制,對高效保護庫區的生態環境、充分利用土著生物改善消落帶生態具有重要意義。

中華蚊母樹(Distyliumchinense)是金縷梅科(Hamamelidaceae)蚊母樹屬(Distylium)多年生常綠河岸帶小灌木[22],是三峽庫區河岸帶的優勢樹種和表征種[23],具有耐淹性好、適應性強等特點,其根系發達、生長快,分布廣泛,是三峽庫區消落帶理想的防沙固土樹種。同時,也是一種較好的園林綠化植物[24]。目前研究主要集中在半淹或全淹等單一因子對中華蚊母樹形態、光合作用等方面的變化[25—26],而關于干旱-水淹交叉脅迫下,中華蚊母樹形態及ROS代謝的生理適應機制尚未見報道。本文通過研究干旱-水淹交叉脅迫及恢復生長階段施加不同外源物質(Glu、ABA、Pro),對中華蚊母樹幼苗的形態及ROS清除的狀況,擬解決以下3個問題：(1)作為三峽庫區河岸帶優勢樹種的中華蚊母樹,在遭受干旱-水淹交叉脅迫時,其在形態學方面產生哪些適應性機制？(2)在遭受干旱-水淹交叉脅迫后,如果中華蚊母樹能夠存活和恢復生長,那么中華蚊母樹的ROS清除系統會產生哪些變化？(3)脅迫恢復階段,施加外源物質,是否對中華蚊母樹的恢復生長產生影響？通過對上述問題的回答以闡明中華蚊母樹對干旱-水淹交叉脅迫的形態和ROS代謝的適應機制,可為進一步研究如何提高其在消落帶生境存活率提供基礎科學數據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

2017年9月中下旬采集野外種群隨機成熟的種子,共計2000粒,種植在15cm×13cm的塑料盆中讓其自然萌發生長,種植基質選用腐殖質土和壤土(按1∶4的比例混合均勻,土壤pH為6.25,土壤含水量為27.32%,土壤容重為1.38g/cm3),盆內土層厚度約為12cm,所有幼苗具有相同的生長環境,且給予除草等常規管理。生長一年后,用于室外模擬實驗,實驗設置在三峽大學生態實驗基地(111°32′E,30°73′N,海拔高度134m,年平均降雨量992.1—1404.1mm)進行。

1.2 實驗設計

于2018年12月從移栽苗中挑選長勢和大小相近的450盆進行實驗處理。將實驗用苗隨機分為5組,每組90盆,每組再隨機分為30盆,共3個重復,每個重復30盆。其中,10盆用于形態學調查,20盆用于生理生化指標的測定。共設置4個階段,階段1為干旱階段,包括對照組(常規供水,CK)、4組干旱(簡稱D)處理,共計5個處理組,每個處理組3個重復,每個重復30盆,每個處理組為90盆。對照組CK即為正常供水組,土壤含水量保持在田間持水量的80%(土壤含水量采用稱重法確定)。干旱時間設置4周；階段2為干旱恢復階段,將階段1的CK組繼續常規供水,D處理組于干旱階段結束當天施加3種不同外源物質(4mg/L ABA[27]、30mg/L Pro[28]、360mg/L Glu[29]),葉面均勻噴施ABA(簡稱A)和Pro(簡稱P)、根部澆灌Glu(簡稱G)以及脅迫后不施加外源物質(簡稱N),見圖1。此時,干旱恢復處理(簡稱R)組包括常規供水(CK)、施加脫落酸(該處理簡稱D-R-A)、施加脯氨酸(該處理簡稱D-R-P)、施加葡萄糖(該處理簡稱D-R-G)及脅迫恢復不施加外源物質(該處理簡稱D-R-N)5個不同處理組。干旱恢復生長設置3周；干旱恢復階段結束后,立即將幼苗浸水進行水淹(F)階段。階段3為水淹階段,將階段2的CK處理組常規供水(CK),其他4個處理組進行水淹處理,共5個處理組,水淹時間設置9周；階段4為水淹恢復階段,將階段3的處理組(不包括CK)施加3種外源物質,此時,水淹恢復處理組包括常規供水(CK)、施加脫落酸(該處理簡稱D-R-A-F-R-A)、施加脯氨酸(該處理簡稱D-R-P-F-R-P)、施加葡萄糖(D-R-G-F-R-G)及不施加外源物質(該處理簡稱D-R-N-F-R-N)5個不同處理組,水淹恢復生長設置3周。

干旱及水淹處理植株放于80cm×50cm×40cm的塑料籃內,每個塑料籃放15盆,共計24個塑料籃,3種外源物質4個處理(不包括CK),每個處理3次重復,每個重復30盆,共360株,干旱、水淹及正常處理放置于13個水池(2m×1.5m×2.5m)中進行(干旱6個水池、水淹6個水池、正常處理1個水池)；對照處理進行常規供水,定期更換水池中的水,實驗示意圖見圖1。盆內土層厚度約為12cm,所有植株置于三峽大學生態實驗基地生長。干旱從2018年10月25日開始,干旱采取自然連續干旱模式,每5天采用稱重法測一次土壤含水量,直至土壤含水量達到30%停止干旱,11月22日停止干旱復水恢復至12月13日,繼續進行水淹處理至2019年2月14日停止水淹恢復至3月7日。采取裂區設計的方法,水池隨機放置植株和塑料籃,每兩周隨機輪換一次位置,以此減少位置效應的影響。同時,由于模擬用水相對清澈,為充分模擬庫區消落帶水體渾濁帶來的低光強環境,在水池上方布設一層遮陽網,使到達水下植物的光照強度小于10μmol m-2s-1[30]。所有植株實驗期間均不施肥。

圖1 實驗設計圖Fig.1 Experimental design drawingA：脫落酸 Abscisic acid；P：脯氨酸 Proline；G：葡萄糖 Glucose；C：對照 Control；N：進行脅迫處理但恢復階段不施加外源物質 Stress treatment was carried out but no allogenic materials were applied in the recovery stage

在干旱及水淹處理的最后一天,與干旱及水淹恢復處理的最后一天,于每個重復內隨機采集長勢良好的葉片10片,洗凈,并用定性濾紙擦干后迅速放入液氮,速凍5min,放置于超低溫冰箱(-78℃)保存,用于生理生化指標的測定。

1.3 形態特征的測定

每個處理期最后一天,測定用于形態學調查的10株植物的株高、基徑、不定根數、葉片數及嫩枝數。

1.4 生理指標的測定

參照Giannopolitis等[31]的方法檢測SOD活性。50μL酶液加入0.3mL 13mmol/L Met、0.3mL 1.3μmol/L核黃素、0.3mL 63μmol/L NBT、1.5mL 50 mmol/L PBS(pH 10.2)、0.3mL 0.1mmol/L EDTA、0.25mL蒸餾水。于4000 lx日光下反應20min,測定560nm處吸光值。

參照Wang等[32]的方法檢測CAT活性。0.5mL酶液中加入2mL 50mmol/L PBS (pH7.0)、0.5mL 40mmol/L H2O2,于240nm下測定H2O2的分解率。

參照Kanamoto[33]的方法檢測APX活性。0.1mL酶液中加入0.1mL 0.1mmol/L EDTA、0.1mL 0.5mmol/L ASA、1.6mL 50mmol/L PBS(pH 7.0),加入0.1mL 0.1mmol/L H2O2啟動反應,測定290nm處吸光值。

參照Bates等[35]的方法測定Pro含量。稱取0.5g葉片,加入10mL 3%磺基水楊酸沸水提取10min,3000r/min離心10min。取2mL清液,加入2mL冰醋酸、2mL 2.5%酸性茚三酮,沸水浴100min,加入甲苯萃取色素,于520nm測定甲苯相吸光度。采用脯氨酸標準品繪制標準曲線,計算Pro含量。·OH采用ELISA試劑盒(南京建成)測定。

1.5 數據分析

采用R語言對數據進行圖表繪制和統計分析。水淹、干旱脅迫對幼苗的影響,采用aov()函數進行單因素方差分析；利用corrgram包中的corrgram()函數作出相關系數矩陣圖,以檢驗施加不同外源物質對ROS清除的影響,采用multcomp包中的glht()函數進行單因素方差分析,并進行多重比較；為了比較ROS清除系統的相對重要性,采用psych包的principal()函數進行PCA分析,以對ROS清除系統進行檢驗。采用Excel 2010和SPSS 19.0數據分析軟件對形態指標的差異性采用單因素方差分析(One-way ANOVA,Duncan′s multiple range test多重比較)。

2 結果與分析

2.1 干旱-水淹交叉脅迫對中華蚊母樹形態學特征的影響

經過干旱4周恢復至正常生長,后再水淹脅迫9周對中華蚊母樹幼苗形態學特征產生了顯著影響(P<0.05)。中華蚊母樹幼苗經過4周干旱脅迫后,株高、基莖、不定根數、葉片數及嫩枝數與對照沒有顯著差異,但經過后期水淹脅迫9周后,較對照組株高顯著降低,生長減緩,基莖顯著增加,不定根也顯著增加,葉片脫落,嫩枝略有增加但不顯著(表1)。結果表明干旱-水淹交叉脅迫過程中幼苗形態特征的變化,有利于幼苗適應后期水淹脅迫的低氧條件,表明前期干旱脅迫促進了對后期水淹脅迫的耐受性。

表1 干旱和水淹交叉脅迫對中華蚊母樹形態學特征的影響(均值±標準誤)

2.2 干旱-水淹交叉脅迫對中華蚊母樹ROS代謝的影響

圖2 干旱和水淹交叉脅迫對中華蚊母樹幼苗ROS含量及ROS清除的影響Fig.2 Effects of alternate drought and flooding stresses on ROS content and ROS clearance of D. chinense seedlingsROS: 活性氧 Reactive oxygen species;不同處理間標有不同字母者表示差異顯著(P<0.05)

2.3 脅迫恢復期施加不同外源物質對ROS清除的協同作用

圖3 恢復期施加不同外源物質,中華蚊母樹酶促系統、非酶促系統、ROS的相關系數矩陣圖Fig.3 The matrix diagram of correlation coefficient of enzymatic system, non-enzymatic system and ROS of D. chinensewith different exogenous substances during the recovery growth 超氧陰離子自由基 Superoxide anion free radical；·OH：羥自由基 Hydroxyl radical; SOD：超氧化物歧化酶 Superoxide dismutas;；APX：抗壞血酸過氧化物酶 Ascorbate peroxidase；CAT:過氧化氫酶 Catalase; Pro：脯氨酸 Proline

2.4 恢復期施加不同外源物質對中華蚊母樹幼苗的影響

干旱與水淹恢復階段施加ABA、Pro、Glu等外源物質,中華蚊母樹幼苗ROS含量及ROS清除系統產生了差異(圖4和圖5)。外源添加Pro,SOD、CAT、APX活性升高,·OH與含量降低；外源添加Glu,SOD、CAT、APX活性未升高,但·OH與含量降低；外源添加ABA,內源Pro含量升高。說明外源添加Pro,可能是通過增強SOD、CAT、APX等保護酶的活性,進而清除ROS；外源添加Glu,保護酶未增強,但植株具有清除ROS的其他途徑；外源添加ABA,可誘導植株內源Pro的生成,進而可清除·OH。同時,外源施加ABA,與內源Pro含量表現出強的正相關性。

圖4 干旱脅迫恢復階段施加不同的外源物質(ABA、Glu、Pro)對中華蚊母樹幼苗ROS含量及ROS清除的影響Fig.4 Effects of different exogenous substances (ABA, Glu, Pro) on ROS content and ROS clearance of D. chinense seedlings during the recovery growth of drought stressD-R-A：干旱-恢復施加脫落酸 Drought-recovery with abscisic acid (ABA)； D-R-N：干旱-恢復不施加任何物質Drought-recovery with no any matter；D-R-G：干旱-恢復施加葡萄糖 Drought-recovery with glucose(Glu)；CK：對照 Control； D-R-P：干旱-恢復施加脯氨酸 Drought-recovery with proline (Pro)

圖5 干旱-水淹恢復階段施加不同的外源物質(ABA、Glu、Pro)對中華蚊母樹幼苗ROS含量及ROS清除的影響Fig.5 Effects of different exogenous substances (ABA, Glu, Pro) on ROS content and ROS clearance of D. chinense seedling during the recovery growth of drought-flooding stressesD-R-A-F-R-A：干旱-恢復施加脫落酸-水淹-恢復施加脫落酸 Drought-recovery with abscisic acid (ABA)-flooding-recovery with ABA； D-R-N-F-R-N：干旱-恢復不施加任何物質-水淹-恢復不施加任何物質 Drought-recovery with no any matter-flooding-recovery with with no any matter; D-R-G-F-R-G: 干旱-恢復施加葡萄糖-水淹-恢復施加葡萄糖Drought-recovery with glucose(Glu)-flooding-recovery with Glu；CK: 對照 Control; D-R-P-F-R-P：干旱-恢復施加脯氨酸-水淹-恢復施加脯氨酸 Drought-recovery with proline (Pro)-flooding-recovery with Pro

3 討論

3.1 干旱-水淹交叉脅迫對中華蚊母樹形態學特征的影響

水淹脅迫后,水分過多會引起土壤通氣性差和植株根際周圍缺氧[19]。這種不良的根際環境會影響根系對水分和礦物質的吸收和轉運,從而引起植株生長減慢和葉片衰老脫落。脅迫后,植株的生長狀況可作為判斷植株幼苗水淹耐受能力的重要指標之一[36- 37]。經過4周干旱脅迫恢復后再水淹脅迫9周對中華蚊母樹的生長影響顯著(表1)。中華蚊母樹在形態學上對水分脅迫表現出了適應性。面臨水淹脅迫,植物可能具有兩種策略：耐受性與逃避策略[38]。中華蚊母樹幼苗在遭受水淹脅迫時,葉片的減少可能有利于植株的存活,植株通過脫落葉片的耐受性策略來應對厭氧代謝等造成的巨大消耗,以此保證根部的存活。同時中華蚊母樹植株為適應這種水淹缺氧狀態,在水淹初期開始形成少量不定根、莖基部開始膨大,隨著水淹時間的延長形成更多的不定根,莖基部膨大部分形成大量皮孔,莖增粗[25]。水淹過程中不定根和肥大皮孔的產生,這是耐淹木本植物對水淹的標志性形態反應之一[39]。有研究表明這些肥大的皮孔有大量的細胞間隙增強了氣體擴散,給被水淹的根系提供氧氣,是莖和不定根在大氣和內部組織間進行氣體交換的一種重要途徑,以便于植物在水淹脅迫下度過不良的外界環境[19,25,39]。同時,在水淹脅迫過程中不定根的形成通過給植株提供水分、礦物質和激素來維持其生長,使植株耐受水淹[40]。就不定根的發生和莖基部膨大的皮孔來講,中華蚊母樹在形態上表現出對水淹有一定的適應能力。由此可見,前期干旱脅迫促進了中華蚊母樹對后期水淹脅迫的適應,如通過葉片脫落、形成不定根及莖基部膨大等形態學的變化增強植物對水淹脅迫的適應。

3.2 酶促系統對中華蚊母樹清除非生物脅迫冗余ROS的影響

圖6 非生物脅迫下,中華蚊母樹ROS可能的產生途徑及外源物質對清除ROS的促進作用Fig.6 Under abiotic stress, the possible ROS production pathways and the promoting effect of allogenic material on scavenging ROS in the D. chinensePPP：磷酸戊糖途徑 Pentose phosphate pathway；NADPH：還原型輔酶II,尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(還原態)Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate(reduced state)；NADP+：尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(氧化態) Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate(oxidation state)； NOX：NADPH氧化酶 NADPH oxidase；ASA-GSH：抗壞血酸-谷胱甘肽 Ascorbic-glutathione

3.3 非酶促系統對中華蚊母樹清除非生物脅迫冗余ROS的影響

圖7 干旱與水淹階段酶促系統及非酶促系統在清除ROS中的貢獻率Fig.7 Contribution rate of enzymatic and non-enzymatic system on ROS scavenging during drought and flooding stresses

3.4 外源物質的添加對中華蚊母樹冗余ROS清除的影響

逆境脅迫解除后的快速生長恢復能力是判斷消落帶岸生物種幼苗水淹耐受能力的重要指標之一[30]。Stewart等采用ABA處理干旱脅迫小麥葉片,Pro大量積累,表明外源添加ABA,可誘導植株內源Pro的積累,進而清除·OH[15]。外源施加ABA后,中華蚊母樹的Pro顯著增加(圖4和圖5),有利于·OH的清除。施加Pro后,中華蚊母樹幼苗CAT、APX酶活性顯著增強(圖4和圖5),表明外源施加Pro,中華蚊母樹可能通過增強CAT與APX等抗氧化酶系統的活性,進而清除環境壓力產生的冗余ROS。在應對應激脅迫時,植物體內的可溶性糖含量將大量增加[51],Glu可通過氧化的PPP(磷酸戊糖途徑)提高NADPH的產生,而NADPH是ASA-GSH循環的重要輔助因子[17],同時Glu的添加與·OH表現出顯著的負相關(圖4)。但外源施加Glu,保護酶活性未顯著升高(圖4)。因此,我們推斷外源添加Glu,可能是通過增強中華蚊母樹的ASA-GSH循環,從而以ASA為底物的APX將H2O2降解為H2O,同時,可間接降低·OH的含量(圖6)。因此,ABA、Pro、Glu等外源物質的施加,可促進中華蚊母樹對逆境脅迫產生的冗余ROS的有效清除。

3.5 干旱-水淹交叉脅迫對中華蚊母樹逆境脅迫耐受能力的影響